نشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ ماوس: التيلوميراز غير المشعة كرر بروتوكول التضخيم (TRAP) الفحص
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
التيلوميراز، وهو بروتين نووي ريبوزي، هو المسؤول عن الحفاظ على طول التيلومير وبالتالي تعزيز النزاهة الجيني، والانتشار، وعمر. بالإضافة إلى ذلك، التيلوميراز يحمي الميتوكوندريا من الاكسدة ويمنح المقاومة لموت الخلايا المبرمج، مما يشير إلى الأهمية المحتملة على قيد الحياة من غير الإنقسامية، خلايا نشطة للغاية مثل الخلايا العصبية. أثبتنا سابقا قدرة تفعيل التيلوميراز جديدة لزيادة النشاط التيلوميراز والتعبير في مختلف المناطق الماوس الدماغ وتحمي الخلايا العصبية الحركية من الاكسدة. هذه النتائج تعزز فكرة أن التيلوميراز تشارك في حماية الخلايا العصبية من الآفات المختلفة. التأكيد على دور التيلوميراز في الدماغ، ونحن هنا مقارنة النشاط تيلوميراز في الذكور والإناث الماوس الدماغ واعتمادها على العمر. TRAP الفحص هو الطريقة القياسية للكشف عن النشاط التيلوميراز في الأنسجة المختلفة أو خطوط الخلايا. نحن هنا لشرح analyجهاز الأمن والمخابرات النشاط التيلوميراز في ثلاث مناطق من الدماغ الماوس عن طريق غير تغيير طبيعة استخراج البروتين باستخدام CHAPS الاحتياطي تحلل تليها تعديل TRAP الفحص القياسية.
في هذا 2 خطوة الفحص، التيلوميراز الذاتية يستطيل ركيزة التيلوميراز محددة (TS التمهيدي) وذلك بإضافة 6 يكرر TTAGGG مضت (التيلوميراز رد فعل). وتتضخم المنتجات رد فعل التيلوميراز عن طريق تفاعل PCR خلق سلم DNA من 6 الزيادات مضت. يتم إجراء تحليل للسلم DNA بنسبة 4.5٪ عالية الدقة هلام الاغاروز الكهربائي تليها تلطيخ مع حساسة للغاية وصمة عار الحمض النووي.
بالمقارنة مع فحص TRAP التقليدية التي تستخدم 32 P المسمى المشعة في dCTP للكشف عن الحمض النووي وبولي أكريلاميد الكهربائي للهلام لحسم سلم الحمض النووي، وهذا البروتوكول يوفر الوقت غير سامة إنقاذ TRAP الفحص لتقييم نشاط التيلوميراز في مخ الفأر، مما يدل على القدرة على كشف الفروق في telomerasنشاط البريد في مختلف المنطقة الماوس الدماغ الإناث والذكور.
Introduction
التيلوميراز هو بروتين نووي ريبوزي تتألف من التيلوميراز الناسخ العكسي (TERT)، الوحيدات الحفاز تيلوميراز، ومكون RNA (TERC). دور الكنسي تيلوميراز هو الحفاظ على طول التيلوميرات السليم للطريق إضافة سلاسل متكررة (TTAGGG) إلى نهايات الكروموسومات، وبالتالي تعزيز النزاهة الجينومية، وانتشار الخلايا 1. ونسبت أدوار إضافية لTERT في الخلايا، أي أنه يمنح مقاومة لموت الخلايا المبرمج الناجمة عن مختلف عامل ضار 2، يحمي الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان من الإجهاد التأكسدي 3، ويلعب دورا المؤيدة للبقاء في الخلايا العصبية متباينة بالكامل من قبل ارتباطه إلى TIA1 RNA إيجابي حبيبات 4.
وأعرب عن TERT وتنشط بشكل رئيسي في الخلايا الجسدية وتقسيم في معظم أنواع السرطان، في حين يتم تنظيم مستويات التعبير والنشاط بإحكام انزيم في الخلايا غير تقسيم 5،6. وقد أظهرت الدراسات أن في صodent الدماغ، ويصبح النشاط التيلوميراز لا يمكن الكشف عنها من قبل يوم 10 بعد الولادة، بينما يتم الحفاظ TERT مرنا في المستويات الدنيا في مرحلة البلوغ 7. وأظهرت دراسات أخرى التيلوميراز النشاط داخل المنطقة البطيني الفرعية الكبار، البصلة الشمية، والحصين، والمخيخ والقشرة الكبار 8. أثبتنا مؤخرا أن المركبات الجديدة التي تزيد التعبير التيلوميراز والنشاط في الدماغ والعمود الفقري الحبال المبذولة آثار اعصاب في N-ميثيل-D-اسبارتاتي (NMDA) – الفئران المحقونة، أخرت ظهور وتطور مرض التصلب الجانبي الضموري في SOD1 المعدلة وراثيا زاد الفئران وبقاء الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي من هذه الفئران 9. إلى فهم كامل للدور الموالي للبقاء تيلوميراز في الخلايا العصبية في الدماغ و، فمن الضروري لتطوير فحص بسيط وسريع نسبيا حساسة للكشف عن النشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ.
ص الكروموسوماتبروتوكول التضخيم EPEAT (TRAP) هو فحص حساسية معروفة الجمع بين النشاط الكنسي التيلوميراز وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تستخدم ACX المسمى 32 P لdCTP لكشف – في هذا الاختبار، التيلوميراز يضيف TTAGGG يكرر إلى الركيزة التيلوميراز (TS التمهيدي) قليل النوكليوتيد، تليها PCR التضخيم الذي يولد قاعدة 6 أزواج (بي بي) سلم DNA باستخدام TS العكسي التمهيدي. كمية قليلة من المنتجات PCR. يتم حل سلم الحمض النووي عن طريق التسلسل هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). كل من شدة العصابات DNA وطول سلم DNA تعكس كمية جزيئات أنزيم نشطة وprocessivity على التوالي 10.
هذا الاختبار التقليدي يحمل بعض الصعوبات الرئيسية: خطر التعرض للمواد المشعة، كبيرة ويصعب التعامل PAGE التسلسل واستهلاك الوقت من هلام على التوالي وتعرض الفيلم المنتج المشع (بين عشية وضحاها في كل الحالات). </p>
هذا البروتوكول يوفر تحسين الاغاروز مصغرة هلام الفحص القائمة على غير المشعة. يتم حل BP سلم DNA 6 باستخدام 4.5٪ عالية الدقة الاغاروز جل ويتحقق الكشف يستخدم حساسة للغاية وصمة عار الحمض النووي. الجمع بين استخدام عالية الدقة الاغاروز مصغرة هلام وحساسة وصمة عار الحمض النووي يوفر سهولة التعامل مع الفحص، ويزيل خطر التعرض للنشاط الإشعاعي وتقصير كبير في مدة الفحص الشاملة من 3 أيام إلى عدة ساعات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل النشاط التيلوميراز في مخ الفأر عن طريق فحص TRAP يتكون من 4 خطوات رئيسية: 1) استخراج البروتينات من مناطق معينة من أنسجة المخ 2) TS استطالة التمهيدي من التيلوميراز – رد فعل التيلوميراز 3) التضخيم من منتجات التفاعل التيلوميراز بواسطة PCR 4 ) فصل المنتجات PCR باستخدام عالية ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
