마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
텔로 머라 제, 리보은 텔로미어의 길이를 유지하고, 따라서 게놈 무결성, 증식 및 수명을 증진 할 책임이있다. 이러한 뉴런 비 분열, 활성이 높은 세포 생존을 위해 그 중요성이 가능한 제안 또한, 텔로 머라 제는 산화 적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하고 아폽토시스에 대한 저항성을 부여한다. 우리는 이전에 다양한 마우스 뇌 영역에서 텔로 머라 제 활성 및 발현을 증가하고 산화 적 스트레스로부터 운동 신경 세포를 보호하기 위해 신규 한 텔로 머라 활성제의 능력을 보여 주었다. 이러한 결과는 텔로 머라 다양한 병변에서 뉴런의 보호에 관여한다는 개념을 강화한다. 뇌의 텔로 머라 아제의 역할을 강조하기 위해, 우리는 여기에 남성과 여성의 마우스 뇌의 텔로 머라 아제의 활동과 연령에 대한 의존도를 비교합니다. TRAP 분석은 다양한 조직이나 세포주에서 텔로 머라 제 활성을 검출하기위한 표준 방법이다. 여기에서 우리는 analy을 보여CHAPS를 이용한 단백질 추출을 비 변성에 의한 마우스 뇌의 세 지역에서 텔로 머라 제 활성의 SIS는 표준 TRAP 분석의 변형에 의해 버퍼 용해 하였다.
이 2 단계 분석에서 내인성 텔로 머라 제는 TTAGGG 6 BP 반복보기 (텔로 머라 제 반응)을 첨가하여 텔로 머라 제의 특정 기판 (TS 프라이머)로 뻗어. 텔로 머라 제 반응 생성물 (6) 혈압 증가의 DNA 래더를 생성 PCR 반응에 의해 증폭된다. DNA 래더의 분석은 매우 민감한 핵산 염색 얼룩 이어 4.5 % 고해상도 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 이루어진다.
32 P가 DNA 검출 및 DNA 래더를 해결하기위한 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 위해 방사성 dCTP의 레이블 이용하는 전통적인 TRAP 분석법에 비해,이 프로토콜은 마우스의 뇌에서 텔로 머라 제 활성을 평가하는 능력을 입증위한 TRAP 분석법을 절약 무독성 시간을 구비 telomeras 차이를 검출다양한 여성과 남성 마우스의 뇌 영역에서의 전자 활동.
Introduction
텔로 머라 제는 텔로 머라 이루어지는 리보 역전사 효소 (TERT)의 텔로 머라 제 촉매 서브 유닛, 및 RNA 성분 (TERC)이다. 텔로 머라 제의 표준 역할은 따라서 게놈 무결성 및 세포 증식 일을 촉진, 텔로미어 끝까지 반복 서열 (TTAGGG)을 추가하여 텔로미어의 적절한 길이를 유지하는 것입니다. 그것은 다양한 손상 에이전트 (2)에 의해 유도 된 세포 사멸에 대한 저항성을 부여하는, 즉 추가의 역할은 셀에 TERT에 기인하고, 산화 적 스트레스 (3)로부터 인간 중간 엽 줄기 세포를 보호하고, 긍정적 인 RNA를 TIA1 위해 그 연관에 의해 완전히 분화 된 신경 세포 친 생존 역할 과립 4.
효소 발현과 활동 수준이 단단히 비 분할 세포 5,6 규제하는 동안 TERT는 표현 주로 체세포 분열 세포와 암의 대부분의 유형에서 활동한다. 연구는 연구에 그것을 보여 주었다TERT의 mRNA가 성인 7로 낮은 수준에서 유지하면서 odent 뇌는 텔로 머라 제 활성은 출생 후의 일 10에 의해 감지된다. 다른 연구는 성인 하위 심실 영역, 후각 망울, 해마 내에서 텔로 머라 제 활성을 입증하고, 성인 소뇌 피질 8. , 주입 된 생쥐 SOD1 유전자 변형의 근 위축성 측삭 경화증 질환의 발병 및 진행을 지연 – 우리는 최근 뇌 및 척수에서 텔로 머라 제 발현 및 활성을 증가 신규 화합물은 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA)의 신경 보호 효과를 발휘한다는 증명 마우스와이 마우스 (9)의 척수 운동 신경 세포의 생존을 증가했다. 완전히 뉴런에서 뇌에서 텔로 머라 제의 친 생존 역할을 이해하기 위해서는 뇌의 여러 지역에서 텔로 머라 제 활성의 검출을위한 간단하고 비교적 빠르고 민감한 분석법을 개발하는 것이 필수적이다.
텔로미어 연구EPEAT 증폭 프로토콜 (TRAP)의 텔로 머라 제 활성의 표준 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 조합 한 공지 민감한 분석이다. 이 분석에서, 텔로 머라 제는 TTAGGG는 텔로 머라 제 기질에 TS 역방향 프라이머를 사용하여 6 염기쌍 (BP) DNA 래더 생성 PCR 증폭 하였다 (TS 프라이머), 올리고 뉴클레오티드, 반복 추가 -. ACX 32 P가 표지 된 dCTP의은을 검출하는데 사용된다 PCR 제품의 낮은 양. DNA 시퀀싱은 사다리 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 해결된다. 두 DNA 밴드의 강도와 DNA 사다리의 길이는 활성 효소 분자의 양 및 그들의 processivity 각각 10을 반영한다.
이것은 전통적인 분석 몇가지 큰 어려움을 가지고 : (밤새 두 경우) 시퀀싱 PAGE 겔 주행의 시간 소비 및 방사성 생성물 막을 노광 처리 할 크고 단단한 방사성 물질에 노출 될 위험. </p>
이 프로토콜은 개선 된 비 방사성 아가 미니 젤 기반의 분석을 제공합니다. DNA 래더 6 BP 4.5 % 고해상도 아가 로스 겔을 이용하여 해결하고 검출은 매우 민감한 핵산 염색을 이용하여 달성된다. 아가 고해상도 미니 겔 민감한 핵산 얼룩을 이용하는 조합은 분석의 취급이 용이 구비 방사능 노출의 위험을 제거하고 크게 몇 시간 삼일부터 전체 검정 시간을 단축.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR 4에서 텔로 머라 제 반응 3) 텔로 머라 제 반응 생성물의 증폭 – 뇌 조직 2)의 특정 영역에서 1) 단백질 추출 텔로 머라 아제에 의해 프라이머 신장 TS : TRAP 분석법을 통해 마우스 뇌에서 텔로 머라 제 활성의 분석은 4 주요 단계로 구성 고해상도 아가 로즈 겔을 사용하는 PCR 제품) 분리.
DNA 사다리의 PCR 제품 및 PAGE 분리의 민감한 검출을위한 방사성 dCTP 년대의 사용이 수정 TRAP …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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