测量抗体功能的关键是了解免疫力恶性疟原虫疟疾。这个方法描述了可行的裂殖子的纯化和调理作用的依赖性吞噬作用通过流式细胞术测量。
恶性疟原虫裂殖子抗原正在开发作为潜在的疟疾疫苗。免疫抵抗疟疾的一个方面是消除游离裂殖子从血液吞噬细胞。然而评估裂殖子特异性opsonizing抗体的功能性功效是由于裂殖子的短半衰期和主吞噬细胞的变异性的挑战。本文详细描述的是这样一种方法,用于产生可行的裂殖子使用E64蛋白酶抑制剂和裂殖子的使用亲单核细胞系THP-1的测定调理素依赖性吞噬作用。 E64阻止裂殖体破裂,同时允许它们由处理裂殖体的过滤释放的裂殖子的发展。溴化乙啶标记的裂殖子被调理的与人的血浆样品,并添加到THP-1细胞。吞噬作用是通过一个标准化的高通量协议进行评估。可行的裂殖子是评估NUMER的宝贵资源P的项方面恶性生物学,包括免疫功能的评估。此法检测抗体水平与临床免疫疟疾的自然暴露的人有关。该法也可用于评价疫苗诱导的抗体。
抗体的抗恶性疟原虫疟疾的重要性,表明40年前,从超免疫的成年人,当免疫球蛋白被动地被转移到儿童造成病情缓解1重症疟疾。因此,相当大的努力一直试图确定的保护性疟疾免疫的目标,主要是通过测定抗体滴度,以用ELISA肽或细菌表达的蛋白质。基于ELISA的血清学检查也证明研究之间充满变数,并且不涉及抗体的功能2。许多疟疾抗原诱导嗜细胞IgG1和IgG3抗体形象,特别是裂殖子表面抗原3。本小类偏压表明与吞噬细胞的抗体的Fc受体(FcR的)相互作用对于opsonizing antimerozoite抗体4的效应子功能重要的。正在开发中的几个裂殖子抗原疫苗被设计引起巨噬细胞的效应功能5,6,虽然对抗体Fc受体的相互作用在啮齿类动物疟疾模型的重要性显著证据7-9,和最近的一些研究支持功能的抗体和吞噬细胞效应功能的免疫力疟疾在人类的重要性10,11,这方面的研究仍然很差。研究成裂殖子的具体opsonizing抗体已经由两个因素受到限制;难度在隔离良好的品质裂殖子;从原代细胞和吞噬变量的反应。
直到最近,高速离心或Percoll密度梯度被用于从裂殖体破裂文化的培养上清液分离的裂殖子。这些裂殖子很少是可行的,而且往往是由密度梯度离心进一步处理和多次洗涤步骤12,或者冷冻保存11试验后方可使用。这些PROCS弯潜在的分离从裂殖子表面许多周边相关的蛋白质,称为是疟疾的免疫力13抗原的目标蛋白质。最近的半胱氨酸蛋白酶抑制剂反式Epoxysuccinyl-L-leucylamido(4 – 胍基)丁烷(E64)已被用来产生可行的裂殖子。 E64阻止裂殖体破裂,产生膜封闭的裂殖子14,它可以通过过滤打乱解放可行的裂殖子15,16。这种技术已导致许多蛋白质的红细胞浸润15,17-19在空间分辨率和澄清的几个抗疟药16,20的阶段特异性作用。然而,可行的裂殖子的生成保持在技术上具有挑战性。为了帮助这个技术和应用,以免疫功能分析,对可行的裂殖子净化和其使用的一个详细的协议的传播抗体的标准化功能测定:在调理作用和吞噬细胞的合作在这里描述。
这种技术表明了显著提前比以前的体外测定裂殖子调理作用,如嗜中性粒细胞呼吸爆发,抗体依赖性细胞抑制(ADCI),和替代裂殖子的吞噬作用测定。这些测定是由于变异寄生虫的输入和主吞噬细胞11,21的活性重复性差。污染疟原虫色素也可能会深刻地影响吞噬细胞功能22。最近报告的稳健和可重复的裂殖子的吞噬功能试验23采用了前单核细胞株THP-1 24。这是一种理想的细胞类型用于高通量流式细胞仪检测,因为它是无粘性的具体执行的Fc-受体介导的吞噬作用25,26。一个额外的复杂性,同时不变拟tigating吞噬作用是,吞噬作用的程度取决于相对于THP-1细胞和血浆浓度的裂殖子的数量。为了确保实验之间的重现性,裂殖子应列举和规定浓度使用。由于其体积小,流式细胞仪定量分析是必要的。
这里所描述的过程将删除疟原虫色素生成可行的裂殖子,并介绍了这些裂殖子的裂殖子后调理作用和吞噬作用的流式细胞计数的应用程序。虽然技术要求高,所描述的技术可在阐明的裂殖子表面特异性抗体应答的贡献,以自然获得与疫苗诱导的免疫证明是有用的。
为了测量裂殖子的吞噬能力,熟练掌握两种技术是必需的:裂殖子和THP-1细胞吞噬功能测定的净化。为结合这两种技术中最关键的步骤是:1)高度同步的寄生虫; 2)添加E64在正确的时间,得到膜封闭的裂殖子; 3)删除疟原虫色素,避免聚集; 4)用流式细胞仪精确的裂殖子计数; 5)用于血浆的稀释;和6)保持低的细胞密度和THP-1细胞的传代次数。仔细考虑这些关键方面将确保强大的吞噬反应观察。
虽然,这里描述的是制备裂殖子用于评估吞噬作用,该技术可被用于广泛的应用范围。不论往下流的方法,最优裂殖子制剂依赖于正确的定时E64除了以产生裂殖子。这里所描述的E64方法已被证明为yIELD侵入的裂殖子的入侵事件及药物敏感试验15-20高分辨率显微镜的使用。而裂殖子生存能力不是吞噬必不可少的,裂殖子表面涂层的完整性是必需的。因此,这里所描述的E64方法允许产生用于评估抗体应答的表面涂层高质量的裂殖子。作为概括在图1中,如果E64加入太早或太晚膜封闭裂殖子不形成。出于这个原因,高度同步的寄生虫培养物是必需的。这里,使用山梨糖醇及肝素治疗,以紧密地同步D10-GFP的寄生虫培养物,以2小时的窗口进行说明。肝素能促进gametocytogenesis在其他实验室分离,因此应谨慎使用。替代同步方法,例如丙氨酸也可使用,其前提是紧密同步的寄生虫产生29。如果E64添加到异步的寄生虫,较低的道具膜封闭裂殖子钮用来将生产和剩余的寄生虫感染的红细胞要么常破裂或发展形态异常。寄生虫还没有发展成膜包围的裂殖子的存在将导致在过滤器的堵塞和显著降低得到的裂殖子产率。
中的膜封闭裂殖子过滤,疟原虫色素是从消化液泡解放,是作为游离的晶体在溶液中。疟原虫色素是高度致炎和已报道调节单核细胞和巨噬细胞吞噬反应30,31。除了 调节的吞噬作用, 如图2中 ,疟原虫色素可以形成聚集体与溶液中的裂殖子。由于THP-1细胞可以吞噬这些聚集,这可能是抗体介导的吞噬作用的分辨率的主要混杂因素。因此,清除疟原虫色素是必要的,这个实验到AV疟原虫色素对巨噬细胞生物学OID额外的复杂性。此外,未能消除疟原虫色素也可以使用这种技术时,产生游离的裂殖子用于其他应用,尤其是在裂殖子的定量要求是有害的。
如在图4中概述的,加入到测定裂殖子的数目可以由THP-1细胞吞噬作用的影响的程度。虽然流式细胞术允许裂殖子浓度,小心吸液和复制裂殖子的计数列举有必要以提高准确性。如果多个寄生虫线侧由端进行测试,这一点尤为重要。以前已经证明,从PNG半免疫儿童等离子体可显著稀释反应下降23之前。这里描述的是等离子体的最佳稀释度(1/120,等离子体000最终稀释度)为5队列 – 12岁的儿童,PNG,产生的大范围phagocyt的,在图5中描述的尘埃沉着病回应此范围允许的响应分层分为四组(0 – 19%,20 – 39%,40 – 59%,和60 – 79%的吞噬作用),以及回归建模显示,opsonizing反应进行关联从临床疾病和高密度的寄生虫血症10保护对于不同的队列研究,可能有必要调节血浆稀释,以保证吞噬细胞引起的THP-1细胞中不饱和或低于检测水平。
流式细胞仪可以快速和可量化的吞噬作用与提高精度超过显微镜。这个协议是一种高通量,基于板和自动采集的96孔板来研究自然获得的体液免疫。该方法需要裂殖子用溴化乙锭染色,但是替代的DNA污渍如SYBRgreen,DAPI和碘化丙啶,膜的污渍或蛋白质的污渍可以被利用。此法是服从PRIMARÝ单核细胞或嗜中性粒细胞,并可以适应如吞噬细胞或生物的FcR是感兴趣的。 体外分化用PMA的原代细胞或THP-1细胞可用于研究吞噬作用于疟疾和其他病原体12,32-34。然而,使用原代细胞可以是具有挑战性的,因为这些细胞是贴壁,并显示非抗体介导的吞噬作用35。此外,变异纯度,活力和功能的一些主要限制的使用主要吞噬细胞。参与裂殖子的吞噬Fc受体依然未知,因此采用封闭抗体对特定的Fc受体可以阐明各自的Fc受体,以裂殖子吞噬的贡献。由于THP-1细胞吞噬功能的Fc受体依赖,这使得观察到的吞噬简单的解释。该测定也适合于寻址opsonizing可被util的实现抗体的抗原特异性定义敲除寄生于裂殖子表面抗原,或用亲和纯化的人抗体的裂殖子表面蛋白。此外,在深度细胞因子应答的下列裂殖子的吞噬作用研究缺乏,并且可以使用该测定法来实现。
这两项技术构成,以功能antimerozoite抗体的研究相当大的进展。高品质的裂殖子的净化是有利的,使用冷冻裂殖子,或涂裂殖子抗原荧光微球。虽然该试验中已被用作用于评价自然获得性免疫的一个工具,它可能被证明为处理采集的免疫响应于免疫接种的重要工具。而最近已表明,吞噬作用或opsonised裂殖子被保护免于临床疟疾相关联,这是不可能得出结论直接从体外的THP-1细胞吞噬到体内 phagocyto裂殖子吞噬作用在这个实验的SIS静态条件下,并在没有竞争的红血细胞的发生。因此,这个实验的潜在适应可提供一个多功能的工具,进一步了解疟疾和裂殖子吞噬。
The authors have nothing to disclose.
作者要承认儿童和成人血浆者,工作人员在医学研究巴布亚新几内亚研究所。作者要感谢阿曼迪妮乙Carmagnac,凯瑟琳Q聂,丹尼·W·威尔逊,伊沃·穆勒和戴安娜S汉森他们对这项技术的发展作出的贡献,并感谢澳大利亚红十字会血液和血清包。这项工作成为可能,通过维州政府运营基础设施的支撑和澳大利亚政府NHMRC IRIISS。这项工作是由国家健康和医学研究委员会支持授予#1031212和#637406,和国家卫生研究院授予#AI089686。
THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
Human Serum | Donation from Autralian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
heparin Sodium BP (5000IU/mL) | Pfizer | procine origin | |
Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biopsciences | ||
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |