High Yield purificação<em> Plasmodium falciparum</em> Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Nota: Todos os passos de, para além da centrifugação e a citometria de fluxo, deve ser realizada dentro de uma câmara de fluxo laminar, para manter a esterilidade. Assegurar as devidas precauções sejam tomadas em relação a manipulação de amostras humanas. O ensaio é muito sensível para pequenas quantidades de plasma. As diluições fornecidas são ideais para a resolução de respostas que vão 5-78% com plasma de crianças semi-imunes de Papua Nova Guiné (PNG). A diluição ideal pode variar com aparelhos de plasma a ser testado e, portanto, recomenda-se que o plasma ser titulada para determinar as condições experimentais para cada aplicação. Garantir a inclusão de dois controles negativos células THP-1 com merozoites na ausência de plasma; e células THP-1 com merozoites opsonizadas com um pool de plasma de malária indivíduos ingênuos. Isto irá permitir um controlo para a adesão dos merozoítos para células THP-1 e para permitir rigorosa gating citometria de fluxo de eventos de fagocitose. O uso de amostras de plasma foi PNGaprovado pelo Comitê Consultivo de Pesquisa Médica, Papua Nova Guiné Ministério da Saúde, o Walter e Eliza Hall Institute Comitê de Ética em Pesquisa Humana (número do projeto 04/04). Foi obtido consentimento escrito dos pais / encarregados de educação de todos os participantes. 1. THP-1 Cultura Manter a linha celular monocitica humana THP-1 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 55 uM de 2-mercapthoethanol (THP-1 médio) e a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 umidificada. Manter as células a uma densidade inferior a 5 x 10 5 células / ml. NOTA: Supercrescimento irá resultar em diferenciação em células aderentes e infra-regulação de receptores Fc. Uma vez que as células foram passadas a aproximadamente 10 vezes, descongelar um frasco novo para manter o fenótipo da célula. 2. Preparação de Amostras de anticorpos e de diluição Calor plasma inativar a ser testado e plasma controle da malária ingênuo por incubação a 56 °; C durante 30 min Diluir em série de amostras de plasma a 1/2, 000, em células THP-1 de gama média. Plasma loja diluída a -20 ° C. 3. Cultura de Altamente Sincronizado P. falciparum NOTA: A linha parasita expressando GFP-D10-PfPHG 27 foi utilizado devido ao seu ciclo de vida de 48 horas, que auxilia a sincronização de parasitas eo momento controlada de E64 disso. Além disso, porque esta linha expressa GFP no citosol, esta linha permite a detecção de parasitemia e merozoitos livres por citometria de fluxo, detecção de GFP. No entanto, a intensidade de fluorescência da GFP não é suficiente para proporcionar a visualização no interior de células THP-1, e, portanto, os merozoítos são contrastadas com brometo de etídio (EtBr). Outras estirpes do parasita podem ser utilizados, desde que a sincronia apertado é realizável. Sincronizar parasitas utilizando uma combinação de tratamento de sorbitol para lisar as formas maduras de 28 e heparina para inibir a invasão 15 </sup>. Manter P. falciparum parasitas em O + eritrócitos humanos (RBC) em 3% de hematócrito em meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 10% de soro humano, 2 mg / bicarbonato de sódio ml, e 20 ug / ml de gentamicina (meio parasita). Adicionam-se 5 mg / ml de blasticidina S-hidrocloreto ao meio de cultura para seleccionar para GFP + parasitas. Incubar as culturas em caixas estanques ou frascos de cultura, alternativamente dupla selados a 37 ° C numa atmosfera de 1% de O2, 4% de CO2 e 95% de N2. Prepare esfregaço finas, fixar em 100% de metanol durante 10 segundos, e a mancha com uma solução de 10% de Giemsa em 6,7 mM (pH 7,1), tampão fosfato (solução de Giemsa) durante 10 minutos para monitorar a parasitemia. Após a coloração, lavar com água e ar seco. Avaliar a parasitemia usando uma lente de imersão em óleo de 100X. Manter culturas de parasitas em uma parasitemia abaixo de 5% RBC infectado dividindo culturas e adicionando não infectadoRBC, conforme necessário. Para sincronizar com heparina, adicionar 20 UI / ml de heparina de grau médico para tocar em estágio culturas. Quando a maioria dos parasitas estão na fase de esquizonte, células de pelotas a 300 xg durante 5 min, remove-contendo heparina de médio e ressuspender em meio de parasita para permitir a ruptura esquizonte e merozóito invasão. Depois de 4 horas, adicionar 20 UI / ml de heparina de volta para as culturas, bloqueando qualquer outra invasão merozoite. NOTA: Vários ciclos de sorbitol e de tratamento de heparina pode ser necessária antes de parasitas são suficientemente sincronizada. Para gerar números adequados de merozoítos, preparar 150 ml de cultura parasita a 3 – 5% parasitemia. 4. Isolamento de Final Stage P. falciparum Trofozoítos Trinta e seis horas após o retorno da heparina para culturas, sedimentar as células cultivadas a 300 xg durante 5 min, e ressuspender em meio de pelota do parasita a 25% hematócrito. Anexar uma grande coluna magnética (volume de matriz de 6,3ml) para um íman, e equilibrar a coluna com meio de parasita, certificando-se de que todas as bolhas de ar são removidas. Adicionar o P. ressuspensas cultura falciparum para a coluna, e ajustar a taxa de fluxo de uma gota por segundo. Uma vez que a cultura foi passado através da coluna, lava-se a coluna com meio parasita até que o fluxo de passagem corre claro. Eluir parasitas a partir da coluna em 30 ml de 37 ° C meio parasita. Preparar um esfregaço fino de parasitas, fixar em 100% de metanol por 10 segundos, e manchar com solução Giemsa por 3 min. Examine a lâmina sob o microscópio, e garantir que os parasitas quase encher o glóbulo vermelho, e parece estar em estágios iniciais esquizontes. Se os parasitas não tenham atingido a fase de maturação apropriado, retornar parasitas purificados para uma incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 1% de O2, 4% de CO2 e 95% de N2 até desenvolvido adequadamente. NOTA: pureza superior a 90% de células vermelhas do sangue infectados é necessária para assegurar a RBCs não contaminam preparações merozoite. Tratar esquizontes isolado com 10 uM E64 (epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) para 6-10 h NOTA:. Tempos de incubação mais longos com E64 é possível, no entanto, os merozoítos produzidos deixará de ser invasivo. 5. Isolamento de P. falciparum Merozoítos Após a incubação com E64, esfregaço parasitas, fixar as células em 100% de metanol, e a mancha com solução Giemsa para avaliar a formação de merozoítos fechado por uma membrana. NOTA: Um bom rendimento de merozoites será obtida se for maior que 50% dos parasitas formaram membrana merozoites fechados. Pellet E64 tratados esquizontes a 1.900 xg por 8 min. Lava-se com 50 ml de RT meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 2 mg / ml de bicarbonato de sódio, e 20 ug / ml de gentamicina (meio de lavagem) para remover o restante do soro humano . Ressuspender o sedimento em 2 ml de meio de lavagem. NOTA: Usando FCS contendo meio THP-1 vai produzir espuma durante a filtração. Filtrar os 2 ml de ressuspensos E64-esquizontes através de um filtro de seringa de 1,2 mm μm/32. Recolhe-se o filtrado em um tubo de 10 ml. NOTA: O filtrado contém merozoites e cristais hemozoína, com esquizontes rompeu-un e detritos coletados no filtro. Coloque uma pequena coluna magnético de um ímã, e equilibrar com 500 mL THP-1 médio. Passa-se o filtrado sobre a coluna magnética. Recolhe-se o fluxo de passagem. NOTA: hemozoin ligarão à coluna, enquanto merozoítos vai passar. Passar o fluxo de passagem através da coluna mais duas vezes para remover hemozoína, recolhendo o fluxo através de cada vez. Lavar a coluna com 2 ml de RT THP-1 médio de recolher quaisquer merozoites restantes. Adicionar EtBr em 10 ug / ml (concentração final) e mancha durante 30 min à temperatura ambiente. Proteger da luz para evitar a fotodegradação. Nota: Certifique-se que todo o líquido e p EtBr contaminadoresíduos lastic é descartado de forma adequada para produtos químicos citotóxicos. Merozoítos já não são invasivos seguir a esta incubação. Girar merozoites a 4.000 g durante 10 min. Elimine o sobrenadante para um recipiente adequado de lixo. Ressuspender merozoite sedimento em 4 ml de THP-1 médio, e girar para baixo a 4.000 g durante 10 min. Adicionar THP-1 médio até um volume de 15 ml, e proteger da luz. 6. Quantificação Merozoito Concentração por Citometria de Fluxo Traga contando grânulos para a TA. Prepare PBS com 0,5% de BSA para diluir merozoites. Contagem merozóitos em 3 diluições; 1 em 100; 1 em 50 e 1 em 25. Preparar tubos de FACS com 3 940, 930 e 910 ul de PBS, 0,5% de BSA, respectivamente. Adiciona-se 10, 20 e 40 ul de merozoítos purificados por tubo, respectivamente. Pérolas de contagem Vortex durante 30 segundos, e adicionar 50 ul de esferas por tubo de FACS contendo merozoítos diluído. Execute o três dilamostras merozoite buído num citómetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Definir um portão rigorosas para merozoítos baseados em EtBr e a fluorescência de GFP dupla fluorescência, e os grânulos de contagem de porta por meio de fluorescência de um canal separado. Adquirir eventos até 2.000 contas são coletados. Nota: Estas instruções referem-se a contagem de GFP + merozoites que foram contra-corados com EtBr. Se não utilizando GFP expressando parasitas então fixados portões merozoite com base em dispersão lateral e EtBr fluorescência. Determinar a proporção de merozoítos: grânulos, dividindo o número de eventos de merozoítos por contagem dos 2.000 eventos talão, calcular uma proporção para cada diluição. Utilize as especificações de lote contagem de contas para determinar o número de contas na década de 50 mL de contas adicionadas por tubo. Multiplique o número de contas em 50 ul pelo fator de diluição e pelo merozoite: relação talão para que o fator de diluição. Este número é igual à concentração de merozoítos por ml. Realize ªese de passos para cada diluição. Calcular a média dos concentrações merozoite medidos nas três diluições. NOTA: Os desvios padrão acima de 10% para as concentrações determinadas para 1 em 100, 1 em 50 e 1 em 25 diluições indicam imprecisões técnicas na preparação de amostras de contagem. Ressuspender merozóitos em 8 x 10 6 / ml em merozóitos de THP-1, meio para assegurar uma razão final de quatro merozoítos por THP-1 celular. Nota: Outras merozoite para THP-1 índices podem ser usados, e as concentrações devem ser alterados em conformidade. 7. Fagocitose Ensaio Adicionar 200 mL de calor FCS inativos por poço de placas de 96 poços de fundo em U, e deixar à temperatura ambiente O / N para bloquear placas. Após a incubação, remove FCS e lavar os poços duas vezes com 200 ul de PBS estéril. Remover PBS e armazenar as placas a 4 ° C até ser necessário. Calcular o número de células THP-1 necessários para a análise de amostras de plasma e controlos, permitindo poços em triplicado por amostra a 1 x 10 <sup> 5 células THP-1 por poço. Determinar a concentração de THP-1 de cultura através do carregamento de 10 uL de cultura em que um slide de hemocitómetro. Contar o número de células presente em 4 conjuntos de 16 esquinas do hemocitómetro sob um microscópio, em seguida, calcular a média das contagens. Multiplicar a contagem média de 10.000 para calcular o número de células por ml. Girar o número necessário de células THP-1 a 500 xg durante 5 min, e ressuspender em 6,7 x 10 5 células / ml em meio de THP-1. Adicionar 150 ul de células THP-1 em células THP-1 por meio de um poço de FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U, o que resulta em 10 5 células / poço. Preparar 3 poços por exemplo que irá ser testada. Retornar placa para incubadora até que esteja pronto para adicionar merozoites. Adicionar 150 ul de preparação de merozoíto de 8 x 10 6 / ml por poço para uma FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U separados. Prepare um bem por amostra testada Adicionar 10 pi de amostras de plasma diluídas preparadas por poço, para tele placa que contém os merozoítos, e misture bem para garantir a solução homogénea. Remova a placa de células THP-1 a partir do incubador, e adicionar 50 ul da solução de merozoítos / plasma por poço contendo células THP-1, com cavidades triplicadas por amostra de plasma. Misturar bem e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2, incubadora humidificada, durante 40 min. Cubra com papel alumínio para proteger da luz. Após 40 min, as amostras de centrifugação por 5 minutos a 500 xg de um pré-arrefecido a 4 ° C centrífuga para prender a fagocitose. Remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes em PBS gelado 0,5% BSA EDTA 2 mM (tampão FACS). NOTA: EDTA vai facilitar a manutenção de uma suspensão de células individuais por citometria de fluxo. Fix células em 90 ul de 2% de paraformaldeído (PFA) em PBS +0,5% de BSA EDTA 2 mM (FACS fixador). Deixar em gelo até à aquisição, protegido da luz. 8. Citometria de Fluxo Adquirir amostras usando um citômetro de fluxo wi equipadoth um laser de 488 nm e alta taxa de transferência de anexo leitor de placas. NOTA: Este vai permitir que até 400 amostras de plasma para ser testada de uma preparação de merozóito. As células também podem ser transferidas para os tubos de amostra manual de carregamento. Portão viáveis ​​células THP-1 de frente e dispersão lateral. Defina o portão positivo EtBr com base nos 'células THP-1 com merozoites e sem plasma' controle. Adquirir um mínimo de 10.000 eventos por amostra. 9. Data Analysis Analisar dados por citometria de fluxo de software de análise e defina portões rigorosos para eventos positivos EtBr. Calcule a porcentagem de fagocitose para cada amostra: a% de células ETBR + para a amostra menos as células positivas% com plasma não imune. Os resultados médios em todo triplicatas. NOTA: Os desvios padrão para a triplicado em excesso de 10% indicam imprecisões experimentais. Alguns fundo eventos EtBr positivos podem ser observados como resultado de merozoite a adesão à superfície de células THP-1, mas deve ser consistente entre todas as amostras contendo os merozoítos. Definir a porta com base nos 'células THP-1 com e sem plasma merozoites' controle e, em seguida subtraindo qualquer fundo das "células THP-1 com os não-imune plasma" controle resultará em fagocitose% que reflete a fluorescência devido a internalizada / fagocitado apenas merozoites.