High Yield Purificazione di<em> Plasmodium falciparum</em> Merozoiti Per l'uso in opsonizzante anticorpo saggi

NOTA: Tutte le fasi, oltre a centrifugazione e citometria a flusso, devono essere eseguiti entro una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità. Assicurarsi che siano prese opportune precauzioni per quanto riguarda la manipolazione dei campioni umani. Il test è molto sensibile per piccole quantità di plasma. Le diluizioni previste sono ottimali per la risoluzione delle risposte che vanno 5-78% con il plasma dai bambini semi-immuni da Papua Nuova Guinea (PNG). La diluizione ottimale può variare con i set di plasma in fase di test, e perciò si raccomanda che il plasma essere titolato per determinare le condizioni sperimentali per ciascuna applicazione. Garantire l'inserimento di due controlli negativi cellule THP-1 con merozoites in assenza di plasma; e cellule THP-1 con merozoites opsonizzati con un pool di plasma da malaria persone ingenue. Ciò consentirà di controllo per merozoite aderenza alla cellule THP-1 e per consentire rigorosa citometria a flusso gating di eventi fagocitosi. L'uso di campioni di plasma PNG eraapprovato dal Comitato di Medical Research Advisory, Papua Nuova Guinea Ministero della Salute, il Walter e Eliza Corridoio Comitato di Etica umano della ricerca (numero di progetto 04/04). Il consenso scritto è stato ottenuto da genitori / tutori di tutti i partecipanti. 1. THP-1 Cultura Mantenere la linea cellulare monocitica umana THP-1 in terreno RPMI-1640 integrato con siero di vitello fetale al 10% (FCS) e 55 mM 2-mercapthoethanol (THP-1 medium) ed a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. Mantenere le cellule ad una densità inferiore a 5 x 10 5 cellule / ml. NOTA: Overgrowth si tradurrà in differenziamento in cellule aderenti e down-regulation dei recettori Fc. Una volta che le cellule sono state fatte passare circa 10 volte, scongelare un nuovo flacone di mantenere fenotipo cellulare. 2. Preparazione del campione anticorpo e diluizione Il calore inattivare il plasma da testare e plasma di controllo della malaria-naïve incubando a 56 °; C per 30 min Serialmente diluire campioni di plasma a 1/2, 000 in THP-1 medium. Conservare il plasma diluito a -20 ° C. 3. Cultura altamente sincronizzata P. falciparum NOTA: La linea parassita-GFP che esprimono D10-PfPHG 27 è stato utilizzato per la sua 48 ore ciclo di vita che aiuta la sincronizzazione dei parassiti e la tempistica controllata di E64 aggiunta. Inoltre, perché questa linea esprime GFP nel citoplasma, questa linea permette di rilevare parassitemia e merozoiti gratuiti da rilevamento mediante citometria a flusso di GFP. Tuttavia, l'intensità di fluorescenza GFP non è sufficiente a fornire la visualizzazione all'interno di cellule THP-1, e quindi, merozoiti sono contrastate con etidio bromuro (EtBr). Altri ceppi di parassiti possono essere utilizzati, a condizione che la sincronia stretto è realizzabile. Sincronizzare i parassiti utilizzando una combinazione di trattamento sorbitolo per lisare forme mature 28 e eparina per inibire l'invasione 15 </sup>. Mantenere P. falciparum parassiti in O + eritrociti umani (RBC) al 3% di ematocrito in terreno RPMI-1640 (pH 7,4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ipoxantina ml, 10% di siero umano riunito, 2 mg / bicarbonato di sodio ml, e 20 mg / ml di gentamicina (Parasite medio). Aggiungere 5 mg / ml Blasticidin S-cloridrato al mezzo di coltura di selezionare per GFP + parassiti. Incubare culture in scatole a tenuta d'aria o fiasche di coltura alternativa doppia tenuta a 37 ° C in atmosfera di 1% O 2, 4% di CO 2 e il 95% N 2. Preparare vetrini striscio sottile, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchia con il 10% di soluzione di Giemsa a 6,7 ​​mM (pH 7.1) tampone fosfato (soluzione Giemsa) per 10 min per monitorare parassitemia. Dopo la colorazione, sciacquarlo in acqua e aria secca. Valutare parassitemia con un obiettivo a immersione in olio 100X. Mantenere culture parassita in un parassitemia di sotto del 5% RBC infetto dividendo culture e aggiungendo infettoRBC come richiesto. Per la sincronizzazione con eparina, aggiungere 20 UI / ml di medico-grado eparina a squillare stadio culture. Quando la maggior parte dei parassiti sono in fase schizonte, le cellule pellet a 300 xg per 5 minuti, togliere medio contenenti eparina e risospendere in mezzo parassita per consentire la rottura schizonte e merozoite invasione. Dopo 4 ore, aggiungere 20 UI / ml di eparina torna a culture, bloccando ogni ulteriore invasione merozoite. NOTA: Diversi cicli di sorbitolo e trattamento con eparina può essere richiesto prima che i parassiti sono sufficientemente sincronizzati. Per generare numeri adeguati di merozoiti, preparare 150 ml di cultura parassita al 3-5% parassitemia. 4. Isolamento di fase avanzata P. falciparum Trofozoiti Trentasei ore dopo il ritorno eparina a culture, pellet cellule in coltura a 300 xg per 5 minuti, e risospendere pellet in mezzo parassita al 25% di ematocrito. Attaccare una grande colonna magnetica (volume matrice di 6,3ml) ad un magnete, ed equilibrare la colonna con mezzo parassita, assicurandosi tutte le bolle d'aria vengono rimosse. Aggiungere il P. risospeso cultura falciparum alla colonna, e regolare la velocità di flusso di una goccia al sec. Una volta che la cultura è passato attraverso la colonna, lavare la colonna con il mezzo parassita fino a quando il flow-through è pulita. Parassiti eluire dalla colonna in 30 ml di 37 ° C media parassita. Preparare uno striscio sottile di parassiti, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchiare con la soluzione Giemsa per 3 min. Esaminare il vetrino sotto il microscopio, e garantire che i parassiti quasi riempire il globulo rosso, e sembrano essere nelle fasi iniziali schizonte. Se i parassiti non hanno raggiunto la fase di maturazione appropriato, ritorno parassiti purificati ad un incubatore a 37 ° C in atmosfera di 1% O 2, 4% di CO 2 e il 95% N 2 fino adeguatamente sviluppato. NOTA: purezza superiore al 90% infette globuli rossi è necessaria per garantire RBCs Non contaminare le preparazioni merozoite. Trattare schizonti isolati con 10 pM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 guanidino) butano (E64) per 6-10 ore. NOTA: i tempi di incubazione più lunghi con E64 sono possibili, ma i merozoiti prodotti non saranno più invasivi. 5. Isolamento di P. falciparum merozoiti Dopo l'incubazione con E64, striscio parassiti, fissare le cellule in 100% di metanolo, e macchia con soluzione Giemsa per valutare la formazione di merozoiti membrana chiusa. NOTA: Una buona resa di merozoiti sarà ottenuta se superiore al 50% dei parassiti si sono formate membrana merozoiti chiusi. Schizonti Pellet E64-trattato a 1.900 xg per 8 min. Lavare con 50 ml di RT mezzo RPMI-1640 (pH 7.4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml ipoxantina, 2 mg / ml di bicarbonato di sodio, e 20 ug / ml di gentamicina (lavare medio) per rimuovere i residui di siero umano . Risospendere il pellet in 2 ml di terreno di lavaggio. NOTA: Utilizzando FCS contenenti THP-1 media produrrà la formazione di schiuma durante la filtrazione. Filtrare i 2 ml di risospesa E64-schizonti attraverso un filtro a siringa da 1,2 μm/32 mm. Raccogliere il filtrato in una provetta da 10 ml. NOTA: Il filtrato contiene merozoites e cristalli hemozoin, con schizonti non-rottura e detriti raccolti nel filtro. Attaccare una piccola colonna magnetica ad un magnete, ed equilibrare con 500 microlitri THP-1 medium. Passare il filtrato sopra la colonna magnetica. Raccogliere il flow-through. NOTA: hemozoin si legherà alla colonna, mentre merozoites passeranno attraverso. Passare il flow-through sopra la colonna altre due volte per rimuovere hemozoin, raccogliendo il flusso attraverso ogni volta. Lavare la colonna con 2 ml di RT THP-1 media per raccogliere eventuali merozoiti rimanenti. Aggiungere EtBr a 10 pg / ml (concentrazione finale) e colorazione per 30 minuti a RT. Proteggere dalla luce per evitare photobleaching. Nota: assicurarsi che tutto il liquido e p EtBr contaminatirifiuti lastic vengono smaltiti in modo adeguato per le sostanze chimiche citotossiche. Merozoiti non sono più invasive termine dell'incubazione. Spin down merozoiti a 4.000 xg per 10 min. Gettare il surnatante in apposito contenitore per rifiuti. Risospendere merozoite pellet in 4 ml THP-1 media e spin down a 4000 xg per 10 min. Aggiungi THP-1 media fino a un volume di 15 ml, e proteggere dalla luce. 6. Quantificare merozoite Concentrazione mediante citometria di flusso Portare il conteggio perline per RT. Preparare PBS con 0,5% BSA per diluire merozoiti. Conte merozoiti a 3 diluizioni; 1 a 100; 1 a 50 e 1 a 25. Preparare provette 3 FACS con 940, 930 e 910 microlitri di PBS +0,5% BSA, rispettivamente. Aggiungere 10, 20 e 40 pl di merozoiti purificati per provetta, rispettivamente. Perle di conteggio Vortex per 30 secondi, e aggiungere 50 ml di perline per tubo FACS contenente merozoiti diluiti. Eseguire i tre dilcampioni merozoite decentrate su un citometro a flusso dotati di un laser a 488 nm. Impostare un cancello rigoroso per merozoiti basato su EtBr e fluorescenza GFP doppia fluorescenza, e il conteggio cancello beads di fluorescenza in un canale separato. Acquisire gli eventi fino a 2.000 perline vengono raccolti. Nota: Queste istruzioni si riferiscono a contare GFP + merozoiti che sono stati contro-colorate con EtBr. Se non utilizzano GFP che esprimono parassiti quindi impostare porte merozoite basati su side scatter e EtBr fluorescenza. Determinare il rapporto di merozoiti: perline dividendo il numero di eventi merozoite dai 2.000 eventi tallone conteggio, calcolare un rapporto per ogni diluizione. Utilizzare le specifiche lotti tallone conteggio per determinare il numero di perle in 50 ml di perline aggiunti per provetta. Moltiplicare il numero di perline in 50 microlitri per il fattore di diluizione e dal merozoite: branello rapporto per tale fattore di diluizione. Questo numero corrisponde alla concentrazione di merozoiti per ml. Eseguire thESE passaggi per ogni diluizione. La media delle concentrazioni misurate merozoite tutti e tre diluizioni. NOTA: Le deviazioni standard superiori al 10% per le concentrazioni stabilite per 1 in 100, 1 in 50, e 1 su 25 diluizioni indicano imprecisioni tecniche di preparazione dei campioni di conteggio. Risospendere merozoiti a 8 x 10 6 / ml merozoiti in THP-1 medio per garantire un rapporto finale di quattro merozoiti per THP-1 cella. NOTA: Altro merozoite di THP-1 ratio può essere usato, e concentrazioni devono essere modificati di conseguenza. 7. Fagocitosi Assay Aggiungere 200 ml di calore FCS inattivi per pozzetto di 96 piastre ben inferiori a U, e lasciare a RT O / N per bloccare le piastre. Dopo l'incubazione, rimuovere FCS e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di PBS sterile. Rimuovere PBS e le piastre conservare a 4 ° C fino al momento. Calcolare il numero di cellule THP-1 necessarie per analizzare campioni di plasma e controlli, permettendo pozzetti in triplicato per campione a 1 x 10 <sup> 5 THP-1 le cellule per pozzetto. Determinare THP-1 concentrazione cultura caricando 10 ml di coltura su un vetrino emocitometro. Contare il numero di cellule presenti in 4 gruppi di 16 quadrati angolari della emocitometro sotto un microscopio, poi la media dei conteggi. Moltiplicare il conteggio medio da 10.000 a calcolare il numero di cellule per ml. Centrifugare il numero di cellule THP-1 a 500 xg per 5 min, e risospendere a 6.7 x 10 5 cellule / ml in THP-1 medium. Aggiungere 150 microlitri di cellule THP-1 in THP-1 medium per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti con fondo a U, con conseguente 10 5 cellule / pozzetto. Preparare 3 pozzetti per campione che saranno testati. Piastra Ritorno al incubatore fino al momento di aggiungere merozoiti. Aggiungere 150 ml di preparazione merozoite a 8 x 10 6 / ml per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti fondo U-separato. Preparare un pozzetto per ogni campione testato Aggiungere 10 ml di campioni di plasma preparati diluiti per bene, per tegli piastra che contiene i merozoiti, e mescolare bene per garantire la soluzione omogenea. Rimuovere la piastra THP-1 dal termostato, e aggiungere 50 ml di soluzione di merozoite / plasma per pozzetto contenente cellule THP-1, con pozzetti in triplicato per ogni campione di plasma. Mescolare bene e incubare a 37 ° C in 5% di CO 2, incubatore umidificato per 40 min. Coprire con un foglio per proteggere dalla luce. Dopo 40 min, campioni di centrifugazione per 5 min a 500 xg in una 4 ° C prechilled centrifuga ad arrestare fagocitosi. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte in PBS freddo +0,5% BSA 2 mM EDTA (buffer FACS). NOTA: EDTA faciliterà nel mantenere una sospensione singola cella per citometria a flusso. Fissare le cellule in 90 ml di 2% paraformaldeide (PFA) in PBS +0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS fissativo). Lasciare in ghiaccio fino all'acquisizione, al riparo dalla luce. 8. Citometria a Flusso Acquisire i campioni utilizzando un citofluorimetro wi attrezzatath un laser a 488 nm e throughput elevato lettore di piastra di fissaggio. NOTA: Ciò consentirà fino a 400 campioni di plasma da analizzare da una preparazione merozoite. Le cellule possono anche essere trasferiti in provette per uso caricamento del campione. Cancello vitali cellule THP-1 di avanti e scatter laterale. Impostare il cancello positivo EtBr basato sulle 'cellule THP-1 con merozoites e senza plasma' di controllo. Acquisire un minimo di 10.000 eventi per campione. 9. Analisi dei dati Analizzare i dati in citometria a flusso software di analisi, e impostare porte stringenti per gli eventi positivi EtBr. Calcolare la fagocitosi percentuale per ogni campione: la% di EtBr + cellule per campione meno le cellule positive% con plasma non immune. Risultati medi in tutta triplicati. NOTA: le deviazioni standard per un triplice copia in eccesso del 10% indicano imprecisioni sperimentali. Alcuni retroscena eventi EtBr positivi possono essere osservati a seguito di merozoiTE adesione alla superficie di cellule THP-1, ma dovrebbe essere costante per tutti i campioni contenenti merozoiti. Impostazione del cancello sulla base delle «cellule THP-1 con merozoites e nessun plasma 'di controllo, e sottraendo qualsiasi sfondo delle' cellule THP-1 con i non-immune plasma 'di controllo si tradurrà in% fagocitosi che riflette la fluorescenza a causa interiorizzato / fagocitati solo merozoiti.