고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이
Summary
우리는 다중 미세 기반 항체 배열을 사용하여 타액 단백질 프로파일위한 절차를 설명한다. 단일 클론 항체는 공유 보디이 미드 화학을 사용하여 형광 염료로 인코딩 된 4.5 μm의 폴리머 마이크로 스피어에 연결되어 있었다. 변형 된 미소 구체는 형광 샌드위치 면역 분석을 사용하여 침의 단백질 수준을 측정하기 위해 광섬유 마이크로 웰에서 증착되었다.
Abstract
여기서, 우리는 동시에 광섬유 마이크로 스피어 계 항체 배열을 사용하여 침 육 단백질을 측정하기위한 프로토콜을 기술한다. 채용 면역 어레이 기술은 형광 현미경의 사용으로 미세 기반 서스펜션 어레이 제조의 이점을 결합한다. 비디오 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 시판되는 4.5 ㎛의 중합체 미세 물리적 미소 구체 안에 갇혀이 형광 염료의 농도에 의해 분화 된 일곱 가지 유형으로 인코딩되었다. 표면에 카르복실기를 함유하는 미소 구체는 부호화 EDC / NHS 커플 링 화학을 통해 캡쳐 항체 모노클로 개질되었다. 단백질 마이크로 어레이를 조립하기 위해, 인코딩과 기능화 미소 구체의 다른 유형들을 혼합하고, 임의로 화학적 광섬유 다발의 기단부에 에칭 된 4.5 ㎛의 마이크로 웰, 증착. 광섬유 다발 반송로 양 및 m을 묘화에 사용 된icrospheres. 일단 조립, 마이크로 어레이는 병원에서 수집 된 타액 상등액에서 단백질을 캡처하는 데 사용 하였다. 검출은 스트렙 타비 딘 – 컨쥬 형광 프로브, R-피코 에리 트린을 가진 다른 분석을 위해 비 오티 닐화 된 검출 항체의 혼합물을 사용하여 샌드위치 면역 분석법을 기반으로했다. 마이크로 어레이 마이크로 스피어 등록 및 분석 신호 하나를 세 가지 채널, 두 형광 현미경에 의해 촬영되었다. 형광 현미경은 디코딩 및 MATLAB에서 제 알고리즘을 이용하여 분석 하였다.
Introduction
마크 Schena 1990 년대 중반에서 동료에 의해보고되는 최초의 마이크로 어레이 때문에,이 강력한 도구는 생물학 연구 1의 많은 분야에서 활용되고 있습니다. 동시에 혈액과 같은 체액 진단, 여러 단백질을 검출 할 수있는 항체 마이크로 어레이는, 임상 진단 및 바이오 마커 검사 2-10에서 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 타액, 혈액과 같은 분석 물질의 많은 것을 포함하는, 타액 수집 안전한 비 침습적이므로 혈액 바람직한 대안으로 간주되었으며, 최소한 숙련 된 의료인 11-13에 의해 수행 될 수있다. 현재, 타액으로 다중화 단백질 분석은 표적 피 분석 물 (14)의 낮은 농도와 상이한 바이오 마커 (15)의 넓은 농도 범위를 포함하여 여러 가지 중요한 요인에 의해 제한된다.
.여기서, 우리는 육 단백질의 분석을 설명 : 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터페론 감마 – 유도 단백질 10 (IP-10), 인터루킨 -8 (IL-8), 표피 성장 인자 (EGF), 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP-9) 및 인터루킨 -1 베타 (IL-1β) . 방법의 성능은 초기 분석 재조합 단백질을 구성하고 차단 완충액의 표준 용액을 사용하여 확인 하였다. 다른 만성 호흡기 질환의 환자뿐만 아니라 건강한 대조군에서 수집 된 실제 타액 샘플도 만족스러운 성능을 시험 하였다. 이 프로토콜은 다른 단백질 분석 및 기타 마이크로 스피어 기반의 분석에 적용 할 수 있어야합니다. 그것과 비교하여 넓은 동적 범위, 최소한의 비특이적 상호 작용을 감소 샘플 소모 및 저렴한 비용으로 여러 단백질의 낮은 농도의 빠르고 정확하고 재현성 동시 분석을 가능으로이 플랫폼은 분석 화학 분야에 상당한 이점을 제공한다 유사한 효소 결합 면역 분석 (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
연구팀은 다음 단계에 특별한주의를 지불해야한다 : 더 나은 해독 정확성을 위해, 그것은 미세 균일하게 모든 배양에 현탁 확인하고 미소 인코딩 절차에서 단계를 세척 할 필요가있다. 또, 부호화 된 미소 구체 전체 실험을하는 동안 광으로부터 보호 할 필요가있다. 적절한 인코딩 및 저장 절차에 따라, 우리는 전체 디코딩 정확도는 99 % 이상이었다 것으로 나타났습니다. 인코딩 된 마이크로 스피?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 (부여 08UDE017788-05)에 의해 지원되었다. EBP는 과학 기술에 대한 스페인 재단 (FECYT)에서 지원을 인정합니다. 저자는 원고의 중요한 읽기 Shonda T. 게일로드와 Pratyusha Mogalisetti 감사합니다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
