Summary

Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles

Published: October 10, 2013
doi:

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zum Profilieren von Speichelproteinen mit gemultiplexten Basis von Mikroarrays Antikörper. Monoklonale Antikörper wurden kovalent an Fluoreszenzfarbstoff-codierten 4,5 &mgr; m-Mikrokugeln unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie gebunden. Die modifizierten Mikrosphären wurden in faseroptischen Mikrovertiefungen abgeschieden, um Protein-Spiegel im Speichel mittels Fluoreszenz-Sandwich-Immunoassays zu messen.

Abstract

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum gleichzeitigen Messen von sechs Proteine ​​im Speichel unter Verwendung einer faseroptischen Mikrokügelchen basierende Antikörperarray. Die Immuno-Array-Technologie eingesetzt verbindet die Vorteile der Mikrokugel-Suspension auf Basis der Arrayherstellung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Wie in der Video-Protokoll beschrieben, wurden im Handel erhältliche 4,5 um Polymermikrokugeln in sieben verschiedenen Typen, durch die Konzentration der beiden Fluoreszenzfarbstoffe physikalisch innerhalb der Mikrokügelchen eingeschlossen differenziert codiert. Die codierten Mikrosphären, die Oberfläche Carboxyl-Gruppen wurden mit monoklonalen Fänger-Antikörper über EDC / NHS-Kopplungschemie modifiziert. Um das Protein-Mikroarray zusammenzubauen, wurden die unterschiedlichen Typen von kodierten und funktionalisierten Mikrokugeln gemischt und zufällig in 4,5 um Vertiefungen, die an dem proximalen Ende eines faseroptischen Bündels chemisch geätzt wurden abgeschieden. Die Glasfaserbündel wurde sowohl als Träger und für die Abbildung der m verwendeticrospheres. Nach der Montage wurde die Microarray verwendet, um Proteine ​​im Speichel Überstand aus der Klinik gesammelt zu erfassen. Der Nachweis erfolgte auf einem Sandwich-Immunoassay unter Verwendung einer Mischung von biotinylierten Detektionsantikörper für unterschiedliche Analyten mit einer Streptavidin-konjugierten Fluoreszenzsonde, R-Phycoerythrin basiert. Der Mikroarray wurde durch Fluoreszenzmikroskopie in drei Kanäle, zwei für Mikrokügelchen Registrierung und eine für das Assay-Signal abgebildet. Die Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden dann dekodiert und mit einer hausgemachten Algorithmus in MATLAB analysiert.

Introduction

Seit der ersten Microarray von Mark Schena und Mitarbeiter in der Mitte der 1990er Jahre berichtet, hat dieses leistungsstarke Werkzeug in vielen Bereichen der biologischen Forschung 1 verwendet worden. Antikörper-Microarrays, die gleichzeitig mehrere Erfassungs Proteine ​​in diagnostischen Flüssigkeiten, wie Blut, haben wichtige Anwendungen in der klinischen Diagnostik und Screening Biomarker 2-10. Speichel enthält viele der gleichen Analyten wie Blut, hat als eine bevorzugte Alternative zu Blut in Betracht gezogen worden, weil Speichel Sammlung ist sicher, nicht-invasive, und kann von minimal 11 bis 13 ausgebildetes medizinisches Personal durchgeführt werden. Derzeit ist Multiplexproteinanalyse mit Speichelproben von mehreren wichtigen Faktoren ab, einschließlich der niedrigen Konzentration der Ziel-Analyt 14 und dem weiten Konzentrationsbereich der verschiedenen Biomarker 15 begrenzt.

.

Hier zeigen wir die Analyse von sechs Proteine: human vascular endothelial growth factor (VEGF), Interferon-gamma-induziertes Protein 10 (IP-10), Interleukin-8 (IL-8), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Matrix Metallpeptidase 9 (MMP-9), Interleukin-1 beta (IL-1β) . Die Leistungsfähigkeit des Verfahrens wurde zunächst unter Verwendung von Standardlösungen bilden Analyten rekombinanten Proteinen und Blocking-Puffer überprüft. Echtspeichelproben von Patienten mit verschiedenen chronischen Atemwegserkrankungen sowie gesunden Kontrollen gesammelt wurden auch mit zufriedenstellenden Leistung getestet. Das Protokoll ist anwendbar auf andere Protein Analyten und anderen Mikrokügelchensystem sein. Diese Plattform bietet erhebliche Vorteile für den Bereich Analytische Chemie, wie es ermöglicht eine schnelle, genaue und reproduzierbare gleichzeitige Analyse von geringen Konzentrationen von mehreren Proteinen mit einem breiten Dynamikbereich, minimale unspezifische Wechselwirkungen, reduzierte Probenverbrauch und niedrige Kosten im Vergleich zu einer analog Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Protocol

Fig. 1 ist. . Workflow zum Anlegen faseroptischen Mikrokügelchen Antikörperarray Speichel Profilierung (1) Mikrosphären werden intern mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen codiert, (2) die codierten Mikrosphären werden extern mit Protein-spezifischen monoklonalen Antikörpern modifiziert, (3) die Multiplex-Mikrosphären vermischt werden, und (4) nach dem Zufal…

Representative Results

Fluoreszenzbilder von drei Kanälen, die einen kleinen Abschnitt des faseroptischen Bündels in den 2A-C gezeigt. Diese Bilder wurden unter Verwendung eines Algorithmus in Matlab analysiert (wie detaillierter in der Diskussion beschrieben). Die Analyse verwendet sowohl Daten aus der EU-TTA Bildcodierung (2A) und der C30-Codierung Bild (Fig. 2B), um die Mikrosphären zu decodieren, und die Fluoreszenzintensitäten verschiedener Mikrokugeln in dem Bildsignal (Fig….

Discussion

Forscher sollten Sie besonders auf die folgenden Schritte beachten: für bessere Dekodierung Genauigkeit, ist es notwendig zu überprüfen, die Mikrokugeln wurden homogen in allen Inkubation suspendiert und Waschschritte während der Mikrosphären Verschlüsselungsverfahren. Darüber hinaus müssen die codierten Mikrosphären, von Licht während des gesamten Experiments zu schützen. Nach korrekter Kodierung und Lagerungsverfahren, fanden wir, dass die Gesamt Decodierung Genauigkeit von über 99% lag. Die codierten Mikr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Zuschuss 08UDE017788-05) unterstützt. EBP erkennt auch Unterstützung von der spanischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FECYT). Die Autoren danken Shonda T. Gaylord und Pratyusha Mogalisetti für das kritische Lesen des Manuskripts.

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
Eu-TTA dye Fisher Scientific AC42319-0010
THF Sigma-Aldrich 34865-100ML
Amber glass vial Fisher Scientific 03-339-23B
Coumarin 30 dye Sigma-Aldrich 546127-100MG
Microspheres Bangslabs PC05N/6698
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
PBS 10x concentrate Sigma-Aldrich P5493-1L
Water Sigma-Aldrich W4502-1L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-100ML
Tw-20 Sigma-Aldrich P7949-100 ml
BupH MES buffered saline Thermo Scientific 28390
SDS Sigma-Aldrich 05030-500ML-F
NaOH solution Fisher Scientific SS256-500
Safe-lock microcentrifuge tube VWR labshop 53511-997
EDC Thermo Scientific 22980
Sulfo-NHS Thermo Scientific 24510
Human VEGF capture antibody R&D Systems MAB293
Human IP-10 capture antibody R&D Systems MAB266
Human IL-8 capture antibody R&D Systems MAB208
Human EGF capture antibody R&D Systems MAB636
Human MMP-9 capture antibody R&D Systems MAB936
Human IL-1β capture antibody R&D Systems MAB601
Mouse IgG1 isotype control antibody R&D Systems MAB002
StartingBlock (TBS) buffer Thermo Scientific 37542
HCl standard solution 1.0 N Sigma-Aldrich 318949-500 ml
0.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
Protein-free (PBS) buffer Thermo Scientific 37572
Recombinant human VEGF 165 R&D Systems 293-VE
Recombinant human IP-10 R&D Systems 266-IP
Recombinant human IL-8 R&D Systems 208-IL
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG
Recombinant human MMP-9 R&D Systems 911-MP
Recombinant human IL-1β R&D Systems 201-LB
StartingBlock T20 (PBS) buffer Thermo Scientific 37539
Blocker BSA in PBS Thermo Scientific 37525
Biotinylated VEGF detection antibody R&D Systems BAF293
Biotinylated IP-10 detection antibody R&D Systems BAF266
Biotinylated IL-8 detection antibody R&D Systems BAF208
Biotinylated EGF detection antibody R&D Systems BAF236
Biotinylated MMP-9 detection antibody R&D Systems BAF911
Biotinylated IL-1β detection antibody R&D Systems BAF201
Streptavidin, R-phycoerythrin Invitrogen S-21388
Ethanol (200 proof) Sigma-Aldrich E7023-500ML

References

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Cite This Article
Nie, S., Benito-Peña, E., Zhang, H., Wu, Y., Walt, D. R. Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles. J. Vis. Exp. (80), e50726, doi:10.3791/50726 (2013).

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