Hela Mount immunfluorescensfärgning av neonatal mus Retina att undersöka Angiogenesis<em> In vivo</em

Angiogenes är en komplex utvecklingsprocess definieras av bildningen av nya blodkärl från en redan existerande kärl nätverk och regleras av flera signalvägar. Den mest framträdande av dessa är VEGF vägen. VEGF släpps av ischemiska celler och leder till inledandet av angiogena gro i angränsande blodkärl. Den ledande endotelcell från en ny vaskulär sprout är en "spets"-cell, som producerar filopodia att nå ut i riktning mot källan av VEGF, och följs av prolifererande "stjälk" endotelceller. På detta sätt aktiverade endotelceller migrera och proliferera mot ett avaskulärt område där de bildar nya vaskulära rör. För att stabilisera dessa rör för att stödja blodflöde, endotelceller interagera med pericyter och glatta muskelceller, som omger de nya blodkärl ^1. Angiogenes är nödvändig för vaskularisering av embryot och växande vävnader. Däremot bidrar det också till många pathological sjukdomar som cancer, medan defekter i angiogenes är associerade med ischemiska sjukdomar. Utvecklingen av effektiva läkemedelsbehandlingar att reglera angiogenes som ett sätt att behandla sjukdomar är därför av stort intresse. Till exempel kommer effektiva anti-angiogena faktorer minska cancertillväxt, medan proangiogena strategier kan användas för att behandla ischemisk sjukdom. Således modeller av angiogenes är viktigt att förstå regleringen av kärlnybildning och för att utveckla nya terapeutiska strategier för att öka eller minska vaskulär tillväxt.

En grundläggande del av angiogenes forskning är valet av en lämplig vaskulär modell. Många in vitro-modeller har utformats för att återge de grundläggande stegen för angiogenes såsom endothelial cell migration, proliferation och överlevnad ^2,3. En ofta använd in vitro-analys är bildandet av en grenad nätverk av endotelceller på en Matrigel matris, även om thans är inte specifik för endotelceller, och inte heller det ingår stöd av pericyter eller glatta muskelceller. Bedömning av ex vivo groning angiogenes använda kulturen mus organ såsom embryoid kropp-analysen, den aortaringen analysen och fostrets mellanfot analysen möjliggör analysen av angiogenes av endotelceller i samband med ytterligare stödjande celler. Men de viktigaste begränsningarna av dessa analyser är bristen på blodflödet och regression av fartyg över tiden, vilket ger ett begränsat fönster för analys. Därför, för att förstå regleringen av angiogenes mer exakt, är in vivo-modeller krävs, t.ex. de som utvecklats i musen med subkutant implanterade svampar eller matrigel pluggar, liksom bakbenet ischemi modell. Emellertid är dessa modeller utmanande att analysera på grund av den komplexa 3D arkitekturen i neovessels. Däremot har den zebrafisk embryot visat en utmärkt modell för att visualisera angiogenes i helaorganismen ^4. Däremot är musen evolutionärt mycket närmare släkt med människor än zebrafisk, gör musen en önskad modell i många fall. Följaktligen angiogenes av postnatal mus näthinnan utgör en väl karakteriserad metoden för angiogenes forskning. Det ger inte bara en fysiologisk miljö, men också en 2D vaskulär plexus som lätt kan visualiseras med hjälp av lämpliga fluorescerande fläckar. Arkitekturen av fartyget nätverk, endotelial proliferation, groning, perivaskulär cellrekrytering och kärl remodeling kan alla undersökas använder denna teknik.

I neonatal mus näthinnan sker utvecklingen av retinala blodkärl i den första veckan av postnatal liv. Möss, till skillnad från människor, föds blinda och näthinnor bara bli vaskulariserad efter födseln. Retinala kärl uppstår från mitten av näthinnan nära synnerven vid postnatal dag 0 (P0), och de växer av angiogenes att bilda en mycket organiserad vaskulära plexus som når näthinnans periferi med cirka P8 ^5. Blodkärlen utvecklas på ett karakteristiskt sätt med kapillär plexus successivt växer utåt från optiken skivan mot periferin för att generera ett regelbundet alternerande mönster av artärer och vener med en mellanliggande kapillämätverk. Näthinnans blodkärl ger en idealisk modell för att studera angiogenes eftersom fartygen kan lätt identifieras som de växer i vad som egentligen är ett 2D-plan, vilket gör det relativt lätt att undersöka näthinnans blodkärl i platt-mount preparat ^5. Förfarande för isolering av musen neonatal näthinnan för analys av endoteliala responser tip cell under flera timmar ex vivo har rapporterats ^6. Alternativt krävs en mer ingående undersökning av hela retinal kärlsystemet och tillhörande vaskulära markörer immunfärgning av fasta näthinnan prover vid olika stadier av utveckling.

Här ger vien detaljerad beskrivning av en tillförlitlig och tekniskt rättfram metod som vi använder för hela montera färgning av murina retinal vaskulär plexus, från den initiala enucleation av postnatal ögat (se även ⁷⁾ genom färgning protokollen till final avbildning under lupp.