Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em> In vivo</em

Die Angiogenese ist ein komplexer Entwicklungsprozess durch die Bildung neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert und ist durch mehrere Signalwege reguliert. Der prominenteste von ihnen ist der VEGF-Weg. VEGF wird von ischämischen Zellen und führt zur Einleitung der Angiogenese sprießen in benachbarte Blutgefäße freigesetzt. Die führende Endothelzellen aus einer neuen vaskulären Spross ist eine "Spitze" Zelle, die filopodia dass erreichen, in Richtung der Quelle von VEGF erzeugt und wird durch proliferierende "Stiel" Endothelzellen gefolgt. Auf diese Weise aktivierten Endothelzellen migrieren und proliferieren zu einer avaskuläre Region, wo sie neue Gefäßrohren bilden. Um diese Rohre zu stabilisieren, um den Blutfluss zu unterstützen, interagieren Endothelzellen mit Perizyten und glatte Muskelzellen, die die neuen Blutgefäße ¹ umgeben. Angiogenese ist für die Vaskularisierung des Embryos und wachsende Gewebe. Allerdings trägt es auch zu vielen pathologischencal Erkrankungen wie Krebs, während Mängel in der Angiogenese mit ischämischen Erkrankungen. Die Entwicklung effektiver medikamentöser Behandlung, die Angiogenese als Mittel zur Behandlung von Krankheiten zu regulieren ist daher von großem Interesse. Zum Beispiel wird eine wirksame anti-angiogenen Faktoren reduzieren Krebswachstum, während proangiogene Strategien verwendet werden, um Ischämie zu behandeln. Somit sind Modelle der Angiogenese wichtig, ein besseres Verständnis der Regulation der Gefäßneubildung und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu erhöhen oder zu verringern vaskulären Wachstum.

Ein grundlegendes Element der Angiogenese Forschung ist die Wahl eines geeigneten Gefäß-Modell. Viele in vitro Modelle wurden entwickelt, um die grundlegenden Schritte der Angiogenese wie endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben ^2,3 reproduzieren. Ein häufig in vitro-Assay verwendet wird, ist die Bildung eines verzweigten Netzes von Endothelzellen auf Matrigel Matrix, obwohl tsein ist nicht spezifisch für Endothelzellen, noch übernimmt sie in der Regel übernehmen die Unterstützung von Perizyten oder glatten Muskelzellen. Beurteilung der ex vivo Keimung Angiogenese mit Maus Orgelkultur wie Embryoidkörper Assay, der Aortenring-Assay und der fötalen Mittelfußknochen Assay erlaubt die Analyse von Angiogenese von Endothelzellen im Zusammenhang mit zusätzlichen Stützzellen. Allerdings sind die wichtigsten Einschränkungen dieser Assays die mangelnde Durchblutung und die Regression von Gefäßen im Laufe der Zeit, so dass eine begrenzte Fenster für die Analyse. Deshalb, um die Regulation der Angiogenese genauer zu verstehen, werden in-vivo-Modelle, wie sie in der Maus mit subkutan implantierten Schwämmen oder Matrigel Stecker entwickelt erforderlich, sowie die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell. Allerdings sind diese Modelle schwierig zu analysieren aufgrund der komplexen 3D-Architektur der neovessels. Im Gegensatz dazu hat der Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell für die Visualisierung der Angiogenese in der ganzen bewährt⁴ Organismus. Allerdings ist die Maus evolutionär sehr viel enger als die menschliche Zebrafisch verwandt, um die Maus ein bevorzugtes Modell in vielen Fällen. Folglich Angiogenese der postnatalen Maus Netzhaut stellt eine gut charakterisierte Methode der Wahl für die Angiogenese Forschung. Sie ermöglicht nicht nur eine physiologische Umgebung, sondern auch ein 2D Gefäßplexus, die leicht sichtbar gemacht werden können unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen. Die Architektur des Schiffes Netzwerk Endothelproliferation, sprießen, perivaskuläre Zellrekrutierung und Gefäß Umbau kann allen untersuchten mit dieser Technik werden.

In der Neugeborenen-Maus Netzhaut tritt Entwicklung der Blutgefäße der Netzhaut in der ersten Woche der postnatalen Leben. Mäuse, im Gegensatz zum Menschen, der blind geboren werden und die Netzhaut nur vascularized werden nach der Geburt. Retinal Schiffe ergeben sich aus der Mitte der Netzhaut in der Nähe des Sehnervs bei postnatalen Tag 0 (P0) und die Entwicklung von Angiogenese zur Bildung eines sehr anzuordnen,d Gefäßplexus, die Netzhautperipherie erreicht um etwa ⁵ P8. Blutgefäßen entwickeln in charakteristischer Weise mit der Kapillarplexus allmählich und ausgehend von der optischen Platte in Richtung der Peripherie ein regelmäßiges alternierendes Muster von Arterien und Venen mit einem dazwischen kapillares Netzwerk zu erzeugen. Das retinale Gefäßsystem ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese als die Gefäße leicht identifiziert werden, da sie, was im Wesentlichen in einer 2D-Ebene wachsen zu untersuchen, wodurch es relativ einfach, die retinalen Gefäße in flach-mount Zubereitungen ⁵ untersuchen. Verfahren zur Isolierung der Maus Neugeborenen Netzhaut zur Analyse der endothelialen Zell-Antworten Spitze über mehrere Stunden ex vivo wurde ⁶ gemeldet. Alternativ erfordert eine genauere Untersuchung des gesamten Gefäßsystems der Netzhaut und damit verbundene vaskuläre Marker Immunfärbung von festen Proben Netzhaut in verschiedenen Stadien der Entwicklung.

Hier bieten wir Ihneneine detaillierte Beschreibung eines zuverlässigen und technisch geradlinig Methode, die wir verwenden für whole mount Färbung des murinen retinalen vaskulären Plexus, von der ersten Enukleation der postnatalen Auge (siehe auch ⁷⁾ durch die Färbeprotokolle zur endgültigen Bildgebung unter dem Mikroskop.