מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em> בvivo</em

אנגיוגנזה היא תהליך התפתחותי מורכב שהוגדר על ידי היווצרות של כלי דם חדשים מרשת כלי קיים והוא מוסדר על ידי מספר מסלולי איתות. הבולט ביותר של אלה הוא מסלול VEGF. VEGF הוא שוחרר על ידי תאי איסכמי ומוביל לייזום של angiogenic הנבטה בכלי דם סמוכים. התא האנדותל בכלי הדם המוביל מחיטה חדש הוא התא 'קצה', אשר מייצר filopodia שלהושיט יד לעבר המקור של VEGF, ואחריו מתרבה תאי האנדותל "גבעול". בדרך זו, תאי האנדותל המופעלים להגר ומתרבים לכיוון אזור בו הם יוצרים avascular צינורות כלי דם חדשים. על מנת לייצב את הצינורות אלה כדי לתמוך בזרימת דם, תאי האנדותל אינטראקציה עם pericytes ותאי שריר חלק, המקיפים את כלי הדם החדשים ^1. אנגיוגנזה היא חיונית לכלי דם של העובר ורקמות גדלות. עם זאת, היא גם תורמת לרבים pathologiהפרעות cal כגון סרטן, ואילו פגמים באנגיוגנזה קשורים למחלות איסכמי. הפיתוח של טיפולים תרופתיים יעילים לויסות אנגיוגנזה כאמצעי לטיפול במחלה הוא אפוא עניין רב. לדוגמה, גורמים אנטי angiogenic יעילים יפחיתו צמיחת סרטן, בעוד אסטרטגיות פרו angiogenic יכולות לשמש לטיפול במחל איסכמית. לפיכך, מודלים של אנגיוגנזה הם חיוניים כדי להבין טוב יותר את הרגולציה של היווצרות כלי חדשה ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי לשפר או להקטין צמיחת כלי דם.

אלמנט בסיסי של מחקר אנגיוגנזה הוא הבחירה של דגם כלי דם מתאים. רבים במודלים חוץ גופית כבר נועדו לשחזר את הצעדים הבסיסיים של אנגיוגנזה כגון תא האנדותל הגירה, שגשוג והישרדות ^2,3. שימוש תכוף בassay חוץ גופית היא היווצרותה של רשת מסועפת של תאי האנדותל במטריצת Matrigel, אם כי לאשלו אינו ספציפי לתאי אנדותל, ואינו בדרך כלל לשלב תמיכה של pericytes או תאי שריר חלק. הערכה של אנגיוגנזה הנבטה vivo לשעבר באמצעות תרבות איבר עכבר כגון assay embryoid הגוף, assay טבעת אב העורקים ואת assay כף הרגל העוברי מאפשרת הניתוח של אנגיוגנזה של תאי האנדותל בהקשר של תאי תומכים נוספים. עם זאת, המגבלות העיקריות של מבחני אלה כוללים את חוסר זרימת דם ורגרסיה של כלי לאורך זמן, נותנים חלון מוגבל לניתוח. לכן, כדי להבין את הרגולציה של אנגיוגנזה בצורה מדויקת יותר, במודלי vivo נדרשים כגון אלו שפותחו בעכבר באמצעות ספוגים מושתלים מתחת לעור או תקעי Matrigel, כמו גם את מודל איסכמיה האיבר האחורי. עם זאת, המודלים האלה הם מאתגרים לנתח בשל ארכיטקטורת 3D המורכבת של neovessels. לעומת זאת, בעובר דג הזברה הוכיח מודל מצוין לאנגיוגנזה חזותית בכלהאורגניזם ^4. עם זאת, את העכבר הוא קשור אבולוציונית הרבה יותר הדוק לאדם מאשר דג הזברה, מה שהופך את עכבר מודל מועדף במקרים רבים. כתוצאה מכך אנגיוגנזה של רשתית העכבר לאחר הלידה מייצגת שיטה מאופיינת היטב של בחירה עבור מחקר אנגיוגנזה. זה לא רק מספק הגדרה פיזיולוגית, אלא גם כלי דם מקלעת 2D, שניתן בקלות דמיין באמצעות כתמי ניאון מתאימים. הארכיטקטורה של רשת הכלי, התפשטות האנדותל, הנבטה, גיוס תא perivascular ושיפוץ כלי כל יכולה להיחקר באמצעות טכניקה זו.

ברשתית עכבר הילוד, פיתוח של כלי דם ברשתית מתרחש בשבוע הראשון של חיים לאחר לידה. עכברים, שלא כמו בני אדם, נולדים עיוורים ואת הרשתיות הפכו vascularized רק לאחר לידה. להתעורר כלי רשתית ממרכז הרשתית הקרוב לעצב הראייה ביום הלידה 0 (P0), ולפתח על ידי אנגיוגנזה כדי ליצור מאוד לארגןד כלי דם המגיעה למקלעת הפריפריה הרשתית בכ P8 ^5. כלי דם לפתח בצורה אופיינית עם מקלעת הנימים גדלה בהדרגה החוצה מהדיסק האופטי לכיוון הפריפריה כדי ליצור דפוס קבוע לסירוגין של עורקים וורידים עם רשת נימים להתערב. כלי הדם ברשתית מספק מודל אידיאלי ללמוד אנגיוגנזה כפי שניתן לזהות בקלות את כלי כפי שהם גדלים במה הוא בעצם מטוס 2D, ובכך הופכים אותו קל יחסית לבחון את כלי הדם ברשתית בהר שטוח הכנות ^5. שיטה לבידוד רשתית ילוד העכבר לניתוח של תגובות תא אנדותל טיפ על כמה שעות vivo לשעבר כבר דווח ^6. לחלופין, בחקירה מפורטת יותר של כלי הדם ברשתית השלם וכלי דם סמנים הקשורים דורשת immunostaining של דגימות רשתית קבועות בשלבים שונים של פיתוח.

כאן אנו מספקיםתיאור מפורט של שיטה אמינה וטכנית ישר קדימה, כי אנו משתמשים עבור כל צביעת הר כלי הדם ברשתית העכברית מקלעת, מenucleation הראשוני של העין לאחר הלידה (ראה גם ⁷⁾ באמצעות פרוטוקולי הצביעה להדמיה סופית מתחת למיקרוסקופ.