Summary

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em> 생체 내</em

Published: July 09, 2013
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Summary

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을 제공합니다<em> 생체 내</em> 컨텍스트. 정확하게 혈관 신경 얼기를 시각화하는 면역 형광 염색 연구의 이러한 유형의 성공에 필수적이다.

Abstract

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 발아에 의해 정의 된 새로운 혈관 형성의 복잡한 과정이다. 혈관 신생은 암, 실명 및 허혈성 질환 등의 혈관 형성 dysregulated되는 많은 질병, 또한뿐만 아니라 장기 및 조직의 정상적인 발달에 중요한 역할을하지만. 혈관 질병에 특히 새로운 혈관 형성을 시도하고 조절하는 새로운 약물 개발을위한 중요한 목표 그래서 성인 생활에, 혈관은 일반적으로 정지합니다. 더 나은 혈관을 이해하고이를 조절하는 적절한 전략을 개발하기 위해 모델은 정확하게 관련된 다른 생물학적 단계를 반영해야합니다. 동맥, 정맥 및 모세 혈관이 출생 후 첫 주 동안 혈관 신경 얼기를 형성하기 위해 개발 때문에 마우스 신생아 망막 혈관의 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한이 모델은 두 디를 갖는 장점이있다mensional (2D) 구조는 다른 혈관 네트워크의 복잡한 3D 해부학에 비해 간단하게 분석을하고. 출생 후 다른 시간에 망막 혈관 신경 얼기를 분석하여, 그것은 현미경으로 혈관의 여러 단계를 관찰 할 수 있습니다. 이 문서 isolectin 혈관 특정 항체와 형광 염색법을 사용하여 마우스 망막의 혈관을 분석 간단한 절차를 보여줍니다.

Introduction

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 형성에 의해 정의 된 여러 신호 전달 경로에 의해 조절되는 복잡한 발달 과정입니다. 이들 중 가장 눈에 띄는 VEGF 경로입니다. VEGF는 주변 혈관의 싹이 혈관의 개시에 허혈성 세포와 리드에 의해 발표된다. 새싹 새 혈관에서 선도적 인 내피 세포는 VEGF의 근원을 향해 밖으로 도달하는 filopodia를 생산하는 '팁'세포이며, '줄기'내피 세포 증식옵니다. 이러한 방법으로, 활성화 된 내피 세포는 마이그레이션하고 새로운 혈관 튜브를 형성하는 곳 무혈성 지역으로 확산. 혈액의 흐름을 지원하기 위해 이러한 튜브를 안정화하기 위해, 내피 세포는 혈관 주위 세포와 새로운 혈관 1 서라운드 평활근 세포와 상호 작용합니다. 혈관은 태아 성장 조직의 혈관을 위해 필수적이다. 그러나, 그것은 또한 많은 pathologi에 기여암과 같은 칼 장애, 혈관의 결함은 허혈성 질환과 관련된 반면. 질병을 치료하는 수단으로 혈관 신생을 조절하는 효과적인 약물 치료의 개발은 큰 관심을 따라서이다. 예를 들어, 효과적인 안티 – 혈관 요인은 암의 성장을 줄일 프로 혈관 전략 허혈성 질환을 치료하는 데 사용할 수있는 반면됩니다. 따라서, 혈관의 모델은 더 나은 새로운 혈관 형성과 혈관 성장을 강화하거나 줄일 수있는 새로운 치료 전략을 개발하기위한 규정을 이해하는 것이 필수적입니다.

혈관 연구의 기본적인 요소는 적절한 혈관 모델의 선택입니다. 체외 모델의 대부분은 이러한 내피 세포의 이동, 증식과 생존 2,3 등 혈관의 기본 단계를 재현하기 위해 설계되었습니다. 자주 생체 분석에 사용되는이 있지만 t, 리겔 행렬에 내피 세포의 분기 네트워크의 형성이다자신은 내피 세포의 특정 아니며, 일반적으로 혈관 주위 세포 나 평활근 세포의 지원을 통합 않습니다. 이러한 배아 신체 분석, 대동맥 링 분석 및 태아 중족골 분석으로 마우스 오르간 문화를 사용하여 전직 생체 돋아 혈관의 평가는 추가 지원 세포의 맥락에서 내피 세포의 혈관 신생의 분석을 할 수 있습니다. 그러나 이러한 분석의 주요 한계 분석을 위해 제한된 창을주고, 혈액 흐름의 부족으로 시간이 지남에 혈관의 회귀 (가) 있습니다. 따라서, 더 정확하게 혈관 신생의 조절을 이해하고, 생체 내 모델뿐만 아니라 뒷다리 허혈 모델로, 같은 피하 이식 스폰지 또는 Matrigel의 플러그를 사용하여 마우스를 개발 한 것과 필요합니다. 그러나 이러한 모델은 neovessels의 복잡한 3 차원 구조에 의한 분석하기 위해 도전하고 있습니다. 반면에, 제브라 피쉬 배아 전체에 시각화 혈관을위한 훌륭한 모델을 입증했다생물 4. 그러나 마우스는 마우스 많은 경우에 선호하는 모델을 만들고, 진화 훨씬 더 밀접하게 제브라보다 인간에 관한 것입니다. 따라서 출생 후 마우스 망막의 혈관은 혈관 연구를위한 선택의 잘 특성화 방법을 나타냅니다. 그것은 생리적 설정뿐만 아니라 쉽게 적절한 형광 얼룩을 사용하여 시각화 할 수있는 2D 혈관 얼기도 제공한다. 혈관 네트워크 내피 세포 증식, 발아​​, 혈관 주위 세포의 모집 및 혈관 리모델링의 구조는이 모든 기술을 사용하여 조사 할 수 있습니다.

신생아 마우스 망막, 망막 혈관의 발달은 출생 인생의 첫 주에 발생합니다. 마우스는 인간과는 달리, 블라인드 태어나 망막은 출생 후 혈관됩니다. 망막 혈관이 출생 후의 일 0 (P0)에서 시신경 망막 주변의 중앙에서 발생하고, 매우 조직 형성하는 혈관에 의해 개발약 P8 5에 의해 망막 주변부에 도달 D 혈관 신경 얼기. 혈관은 모세 혈관 따위가 점차 개입 모세관 네트워크 동맥과 정맥의 정기 교류 패턴을 생성하는 주변을 향해 광학 디스크에서 바깥쪽으로 성장 특성 방식으로 개발할 수 있습니다. 망막 혈관 따라서 비교적 쉽게 평면 마운트 준비 5 망막 혈관을 검사하고, 그들은 본질적으로 2D 평면 무엇에 성장 혈관이 쉽게 식별 할 수있는 혈관을 연구하는 이상적인 모델을 제공합니다. 몇 시간 전 생체에 내피 팁 세포 반응의 분석을 위해 마우스 신생아 망막을 분리하는 방법은 6보고되었습니다. 또한, 전체 망막 혈관과 관련 혈관 마커에 대한 자세한 조사 개발의 다른 단계에서 고정 망막 표본의 면역 염색이 필요합니다.

여기에 우리가 제공하는우리는 현미경으로 최종 이미지에 얼룩 프로토콜을 통해 (도 7 참조) 출생 후 아이의 초기 적출술에서 쥐 망막 혈관 신경 얼기의 전체 마운트 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 곧장 앞으로 방법에 대한 자세한 설명.

Protocol

달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다. 1. 출생 후의 눈의 안구 적출술 및 고정 옆에 강아지 인도적 사망 마우스를 놓고 가위로 눈을 덮고있는 피부를 제거합니다. 눈을 명백히 가위와 집게를 사용합니다. 탈핵 눈 아래 장소 가위는 시신경과 주변 조직을 잘라 눈을 밖으로 들어 올립니다. 실온에서 2 배 PBS에서 만든 4 % 파라 포름 알데…

Representative Results

절개 후 망막 평면 꽃 (그림 1)과 같다. 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 내피 세포는 안티 – 알파 평활근 액틴 (그림 2)를 사용하여 시각화하는 isolectin B4-Alexa488 염색을 사용하여 혈관 근육 세포를 지원 볼 수 있습니다. 그림 2에서 5 배 목표를 사용하여 저전력보기는 망막의 혈관 조직의 개요를 할 수 있습니다. 또한, 위의 프로토콜에 주어진 항체의 다른 조…

Discussion

여기에 제시된 방법은 혈관의 쉽게 정량화 및 생리학 관련 모델을 만들고, 신생아 마우스 망막의 스테인드 전체 마운트 준비의 이미지를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 처음에는 마우스 아이는 작은 크기와 지구본 모양으로 인해 해부하는 것은 매우 어려울 수 있습니다, 연습과 좋은 해부 도구는 신뢰할 수있는 결과를 위해 필요하므로. 이 눈에서 물 손실 소량의 원인과 절?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 Wellcome 트러스트와 영국 심장 재단에 의해 후원되었다.

Materials

      Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226  
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002  
Histobond slides VWR 631-0624  
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336  
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095  
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000  
      Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638  
Triton X-100 Sigma T9284  
Donkey serum Sigma D9663  
Goat serum Vector S-1000  
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
      Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
      Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
      Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6  
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome  
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R  

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).

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Cite This Article
Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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