Summary

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em> In vivo</em

Published: July 09, 2013
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Summary

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt<em> In vivo</em> Kontext. Immunfluoreszenzfärbung genau visualisieren die Gefäßplexus ist entscheidend für den Erfolg dieser Art von Studien.

Abstract

Angiogenese ist der komplexe Prozess der Bildung neuer Blutgefäße durch die Sprossen neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert. Angiogenese spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der normalen Entwicklung von Organen und Geweben, sondern auch in vielen Krankheiten, bei denen die Bildung von Blutgefäßen ist dysregulated, wie Krebs, Blindheit und ischämischen Erkrankungen. Im Erwachsenenalter sind die Blutgefäße in der Regel Ruhestrom so Angiogenese ist ein wichtiges Ziel für neuartige Medikamentenentwicklung zu versuchen und zu regulieren Gefäßneubildung gezielt in Krankheit. Um besser zu verstehen, Angiogenese und geeignete Strategien zu regulieren entwickeln werden Modelle benötigt, die genau die verschiedenen biologischen Schritte, die beteiligt sind. Die Maus Neugeborenen Netzhaut bietet ein hervorragendes Modell der Angiogenese, weil Arterien, Venen und Kapillaren zu entwickeln, um eine Gefäßplexus während der ersten Woche nach der Geburt bilden. Dieses Modell hat auch den Vorteil, dass ein zwei-didimensionale (2D)-Struktur-Analyse machen einfach im Vergleich mit der komplexen 3D-Anatomie der anderen vaskulären Netzwerken. Durch die Analyse der retinalen Gefäßplexus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt, ist es möglich, die verschiedenen Phasen der Angiogenese unter dem Mikroskop zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt eine einfaches Verfahren zur Analyse des Gefäßsystems einer Maus Netzhaut unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit isolectin und vaskuläre spezifische Antikörper.

Introduction

Die Angiogenese ist ein komplexer Entwicklungsprozess durch die Bildung neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert und ist durch mehrere Signalwege reguliert. Der prominenteste von ihnen ist der VEGF-Weg. VEGF wird von ischämischen Zellen und führt zur Einleitung der Angiogenese sprießen in benachbarte Blutgefäße freigesetzt. Die führende Endothelzellen aus einer neuen vaskulären Spross ist eine "Spitze" Zelle, die filopodia dass erreichen, in Richtung der Quelle von VEGF erzeugt und wird durch proliferierende "Stiel" Endothelzellen gefolgt. Auf diese Weise aktivierten Endothelzellen migrieren und proliferieren zu einer avaskuläre Region, wo sie neue Gefäßrohren bilden. Um diese Rohre zu stabilisieren, um den Blutfluss zu unterstützen, interagieren Endothelzellen mit Perizyten und glatte Muskelzellen, die die neuen Blutgefäße 1 umgeben. Angiogenese ist für die Vaskularisierung des Embryos und wachsende Gewebe. Allerdings trägt es auch zu vielen pathologischencal Erkrankungen wie Krebs, während Mängel in der Angiogenese mit ischämischen Erkrankungen. Die Entwicklung effektiver medikamentöser Behandlung, die Angiogenese als Mittel zur Behandlung von Krankheiten zu regulieren ist daher von großem Interesse. Zum Beispiel wird eine wirksame anti-angiogenen Faktoren reduzieren Krebswachstum, während proangiogene Strategien verwendet werden, um Ischämie zu behandeln. Somit sind Modelle der Angiogenese wichtig, ein besseres Verständnis der Regulation der Gefäßneubildung und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu erhöhen oder zu verringern vaskulären Wachstum.

Ein grundlegendes Element der Angiogenese Forschung ist die Wahl eines geeigneten Gefäß-Modell. Viele in vitro Modelle wurden entwickelt, um die grundlegenden Schritte der Angiogenese wie endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben 2,3 reproduzieren. Ein häufig in vitro-Assay verwendet wird, ist die Bildung eines verzweigten Netzes von Endothelzellen auf Matrigel Matrix, obwohl tsein ist nicht spezifisch für Endothelzellen, noch übernimmt sie in der Regel übernehmen die Unterstützung von Perizyten oder glatten Muskelzellen. Beurteilung der ex vivo Keimung Angiogenese mit Maus Orgelkultur wie Embryoidkörper Assay, der Aortenring-Assay und der fötalen Mittelfußknochen Assay erlaubt die Analyse von Angiogenese von Endothelzellen im Zusammenhang mit zusätzlichen Stützzellen. Allerdings sind die wichtigsten Einschränkungen dieser Assays die mangelnde Durchblutung und die Regression von Gefäßen im Laufe der Zeit, so dass eine begrenzte Fenster für die Analyse. Deshalb, um die Regulation der Angiogenese genauer zu verstehen, werden in-vivo-Modelle, wie sie in der Maus mit subkutan implantierten Schwämmen oder Matrigel Stecker entwickelt erforderlich, sowie die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell. Allerdings sind diese Modelle schwierig zu analysieren aufgrund der komplexen 3D-Architektur der neovessels. Im Gegensatz dazu hat der Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell für die Visualisierung der Angiogenese in der ganzen bewährt4 Organismus. Allerdings ist die Maus evolutionär sehr viel enger als die menschliche Zebrafisch verwandt, um die Maus ein bevorzugtes Modell in vielen Fällen. Folglich Angiogenese der postnatalen Maus Netzhaut stellt eine gut charakterisierte Methode der Wahl für die Angiogenese Forschung. Sie ermöglicht nicht nur eine physiologische Umgebung, sondern auch ein 2D Gefäßplexus, die leicht sichtbar gemacht werden können unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen. Die Architektur des Schiffes Netzwerk Endothelproliferation, sprießen, perivaskuläre Zellrekrutierung und Gefäß Umbau kann allen untersuchten mit dieser Technik werden.

In der Neugeborenen-Maus Netzhaut tritt Entwicklung der Blutgefäße der Netzhaut in der ersten Woche der postnatalen Leben. Mäuse, im Gegensatz zum Menschen, der blind geboren werden und die Netzhaut nur vascularized werden nach der Geburt. Retinal Schiffe ergeben sich aus der Mitte der Netzhaut in der Nähe des Sehnervs bei postnatalen Tag 0 (P0) und die Entwicklung von Angiogenese zur Bildung eines sehr anzuordnen,d Gefäßplexus, die Netzhautperipherie erreicht um etwa 5 P8. Blutgefäßen entwickeln in charakteristischer Weise mit der Kapillarplexus allmählich und ausgehend von der optischen Platte in Richtung der Peripherie ein regelmäßiges alternierendes Muster von Arterien und Venen mit einem dazwischen kapillares Netzwerk zu erzeugen. Das retinale Gefäßsystem ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese als die Gefäße leicht identifiziert werden, da sie, was im Wesentlichen in einer 2D-Ebene wachsen zu untersuchen, wodurch es relativ einfach, die retinalen Gefäße in flach-mount Zubereitungen 5 untersuchen. Verfahren zur Isolierung der Maus Neugeborenen Netzhaut zur Analyse der endothelialen Zell-Antworten Spitze über mehrere Stunden ex vivo wurde 6 gemeldet. Alternativ erfordert eine genauere Untersuchung des gesamten Gefäßsystems der Netzhaut und damit verbundene vaskuläre Marker Immunfärbung von festen Proben Netzhaut in verschiedenen Stadien der Entwicklung.

Hier bieten wir Ihneneine detaillierte Beschreibung eines zuverlässigen und technisch geradlinig Methode, die wir verwenden für whole mount Färbung des murinen retinalen vaskulären Plexus, von der ersten Enukleation der postnatalen Auge (siehe auch 7) durch die Färbeprotokolle zur endgültigen Bildgebung unter dem Mikroskop.

Protocol

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. 1. Enukleation und Fixierung der Augen Postnatale Zeigen human getötet Maus Welpe auf seiner Seite, entfernen Sie die Haut über dem Auge mit einer Schere. Mit einer Schere und Pinzette, um das Auge entkernen. Platz Schere unter dem entkernten Auge, schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe und heben Sie die Augen. In einen 24-Well-Platte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) i…

Representative Results

Nach Präparation der Netzhaut sollte wie eine flache Blume (Abbildung 1) zu suchen. Durch die Verwendung des Protokolls skizzierten können Endothelzellen gesehen mit isolectin B4-Alexa488 Färbung und Unterstützung vaskulären Muskelzellen visualisiert mit anti-alpha Glattmuskelaktin (Abbildung 2). Die Low-Power-Ansicht mit einem 5X Ziel in 2 ermöglicht einen Überblick über das vaskuläre Organisation der Netzhaut. Auch indem Sie eine andere Kombination von Antik?…

Discussion

Die hier vorgestellte Methode bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, Bilder von gefärbten whole mount Präparaten von Neugeborenen Maus Netzhaut zu erhalten, so dass es eine leicht quantifizierbar und physiologisch relevanten Modell der Angiogenese. Zunächst wird die Maus Auge kann es ziemlich schwierig zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe und Kugelform, so dass einige der Praxis und gute Dissektion Werkzeuge für zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind. Präparation der Augen in 2x Konzentration…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust und der British Heart Foundation.

Materials

      Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226  
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002  
Histobond slides VWR 631-0624  
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336  
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095  
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000  
      Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638  
Triton X-100 Sigma T9284  
Donkey serum Sigma D9663  
Goat serum Vector S-1000  
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
      Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
      Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
      Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6  
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome  
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R  

References

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Cite This Article
Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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