In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

Hier presenteren we praktische methoden voor in vivo calcium beeldvorming in C. elegans neuronen. De ontwikkeling van genetisch gecodeerde calcium-gevoelige fluoroforen met een hoge signaal-ruisverhouding wordt C. elegans een relatief eenvoudig en kostenbesparend systeem voor het meten van de neurofysiologie en activiteit. Onze beeldvorming wordt gedaan met een standaard samengestelde microscoop met behulp van wide-field fluorescentie beeldvorming van de algemeen beschikbare fluoroforen. We presenteren verschillende technieken inzet van verschillende fluoroforen en verschillende monster voorbereiding, het bespreken van de sterke en zwakke punten van elk. Gegevens worden gepresenteerd op twee voorbeeldexperimenten. Een uitstekende extra bron op de hier beschreven technieken zijn te vinden in WormBook, "Beeldvorming van de activiteit van neuronen en spieren" door R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Twee belangrijke klassen van genetischautomatisch gecodeerd fluorescerende calcium reporters worden vaak gebruikt in C. elegans: een kanaal GCaMP en FRET-gebaseerde cameleon. Beschrijven we methoden en tonen voorbeelden voor gegevens die zijn gegenereerd door elk.

GCaMP is gebaseerd op een gemodificeerd Green Fluorescent Protein (GFP) die gevoelig is voor de omringende calciumconcentratie. Dit wordt bereikt door fusie van GFP en de hoge affiniteit calcium eiwit calmoduline, zodat de binding van calcium door calmodulin de GFP molecuul brengt in een efficiënte fluorescerende bevestiging ^2. De recente ontwikkelingen in deze fluoroforen genereren uitzonderlijke signaal formaat met tot 500% toename van de fluorescentie-intensiteit over een fysiologische bereik van calcium niveaus en redelijk snel kinetiek van ~ 95 msec stijgtijd en ~ 650 msec decay tijd ^4. Over relatief korte perioden (minuten), kan deze grote signalen zorgen voor lagere resolutie imaging (lagere vergroting) en, gegeven een goed opgevoede initial nulmeting, ontkennen de noodzaak van permanente basislijn of vergelijkende metingen.

Cameleon heeft het voordeel dat een FRET-gebaseerde fluorofoor die een ratiometrische meting vergelijken van twee onafhankelijke kanalen of golflengten ¹ genereert. Het bestaat uit twee fluoroforen (cyaan-en gele-emitterende fluorescerende eiwitten, CFP en YFP) verbonden door een calmoduline eiwit. Het complex is verlicht met blauw licht (440 nm) dat het GVB prikkelt. Binding van calcium brengt de fluoroforen dichter bij elkaar, waardoor fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET) van de CFP (donor) de YFP (acceptor) en waardoor de emissie CFP (480 nm) en neemt de emissie YFP (535 nm) om het . Relatieve calciumgehalte gemeten als de verhouding van de YFP / CFP intensiteit. Cameleon kinetiek langzamer dan GCaMP, gemeten in vivo een stijgtijd van ~ 1 sec en een vervaltijd van 3 sec ⁵ hebben. Echterde verhouding van tegengesteld bewegende signalen verhoogt de signaalgrootte en compenseert een aantal mogelijke artefacten als gevolg van veranderingen in fluorofoor concentratie beweging of aandacht drift en bleken.

Genetisch gecodeerd fluorescerende verslaggevers ontkennen veel van de monstervoorbereiding vereist met exogeen toegediende sondes en C. elegans kleine transparant lichaam maakt beeldvorming binnen de intacte dier met behulp van eenvoudige brede veld fluorescentie. De belangrijkste technische uitdaging in monstervoorbereiding is dan ook om veilig te immobiliseren de dieren. Er zijn een aantal verschillende algemeen gebruikte technieken elk met voor-en nadelen. Met een farmacologisch middel om de dieren verlammen is eenvoudig te implementeren, de bevestiging van meerdere dieren een preparaat (Levamisol, een cholinerge agonist die spierweefsel veroorzaakt grijpen om wordt meestal gebruikt ^6). C. elegans kan ook fysiek inactief worden gemaakt door ze aan te koppelenop stijve 10% agarose ^{7, 8.} Dit minimaliseert impact op de dierlijke fysiologie, laat de lange termijn beeldvorming (uur) en het herstel van meerdere dieren, maar is meer technisch moeilijk. Beide technieken de fysieke toegang tot de dieren (die onder een dekglas) en kan daarom alleen worden gebruikt met bepaalde experimentele stimuli (zoals licht, temperatuur, elektrisch veld of laser schade). Voor stimuli waar fysieke toegang nodig is, zoals aanraking of toediening van chemicaliën, hebben vele studies met succes geplakt C. elegans op zijn plaats (met behulp van veterinaire graad lijm) ^9. Dit is technisch meer uitdagende, is een enkel dier voorbereiding en staat niet toe dat dierlijke herstel. Ten slotte hebben talloze microfluïdische apparaten in dienst die fysiek C. beperken elegans, kan het behoud van dierfysiologie, waardoor de blootstelling aan de meeste soorten stimuli (afhankelijk van het apparaat ontwerp) en maken een snelle uitwisseling en herstel van de dieren <sup> 10, 11. Maar microfluidics extra technische vaardigheden en mogelijkheden in ontwerp, fabricage en uitvoering. In geïmmobiliseerd dieren activiteit en stimulus respons kan over het algemeen worden gemeten in sensorische en interneuronen. De activiteit van de motorneuronen vereist meer geavanceerde technieken voor beeldvorming bij bewegende dieren. Hier presenteren we gedetailleerde methoden gebruik van de twee meest eenvoudige technieken van farmacologische paralyzation en immobilisatie met stijve agarose.

De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om neuronale activiteit en celfysiologie in C. meten elegans. We geven een voorbeeld van elk: GCaMP met de sensorische respons van de ASJ neuron een extern elektrisch veld meten, en het gebruik Cameleon de fysiologische reactie op calcium laser schade van neuron meten. Deze voorbeelden tonen de voordelen en nadelen van de twee soorten fluoroforen en illustreren wat mogelijk is met het systeem.