C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging'de elegans
Summary
Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi ile,<em> C. elegans</em> Için ideal bir model organizma yapar<em> In vivo</emNispeten basit, düşük maliyetli teknikler kullanılarak> nöronal görüntüleme. Burada genetik olarak kodlanmış floresan kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam bir yetişkin hayvanların içinde tek bir nöron görüntüleme açıklamak.
Abstract
Nematod solucanı C. elegans in vivo nispeten basit, düşük maliyetli nöronal görüntüleme için ideal bir model organizmadır. Onun küçük şeffaf gövdeli ve basit, iyi karakterize sinir sistemi sağlam hayvan içindeki kimlik ve herhangi bir nöronun floresan görüntüleme sağlar. Hayvan fizyolojisi üzerinde minimal etkisi ile basit immobilizasyon teknikleri uzun time-lapse görüntüleme sağlar. Böyle Cameleon 1 ve GCaMP 2 olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyuma duyarlı floroforlar gelişimi hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite hem ilgili nöronal kalsiyum in vivo görüntüleme sağlar. Spesifik nöronlarda bu floroforlar eksprese eden transjenik suşların çok sayıda hazır olan veya iyi bilinen teknikler kullanılarak oluşturulabilir. Burada, GCaMP ve Cameleon ikisini de kullanarak in vivo bir nöronun içinde kalsiyum dinamikleri ölçülmesi için detaylı prosedürler açıklanmaktadır. Biz avantajları ve disadvant tartışmakHer iki yaş hem de numune hazırlama (hayvan immobilizasyon) ve görüntü analizi çeşitli yöntemleri. Travmatik lazer hasarı bir nöronun fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak harici bir elektrik alanı ve 2 belirli bir nöronun duyusal yanıt) ölçmek için GCaMP kullanma) 1: Sonunda, iki deney sonuçları sunmak. Bu gibi Kalsiyum görüntüleme teknikleri C. yaygın olarak kullanılmaktadır elegans ve genetik geçmişleri boyunca serbestçe hareket hayvanlar, aynı anda birden fazla nöron ve karşılaştırma ölçümleri için genişletilmiş edilmiştir. C. elegans teknik basitlik ve maliyet diğer model sistemler üzerinde avantaj ile in vivo nöron görüntüleme için güçlü ve esnek bir sistem sunar.
Introduction
Burada C. vivo kalsiyum görüntüleme için pratik yöntemler sunmak elegans nöronlar. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip genetik olarak kodlanmış kalsiyum duyarlı floroforlar gelişimi C. yapar nörofizyoloji ve aktivite ölçümü için nispeten basit ve maliyet etkin sistemi elegans. Bizim görüntüleme yaygın olarak kullanılabilir floroforlar geniş-alan floresan görüntüleme kullanarak standart bir bileşik mikroskop ile yapılır. Biz her birinin güçlü ve zayıf tartışarak, çeşitli floroforlar ve farklı numune hazırlama istihdam çeşitli teknikler mevcut. Veriler daha sonra, iki örnek deneyler sunulmuştur. Burada açıklanan teknikleri üzerine mükemmel bir ek kaynak WormBook, "Görüntüleme nöronlar ve kas aktivitesi" R. Kerr, (bulunabilir http://www.wormbook.org ) 3.
Geneti iki ana sınıflarıCally kodlanmış floresan kalsiyum muhabir yaygın olarak kullanılan C. elegans: tek kanallı GCaMP ve FRET tabanlı Cameleon. Biz yöntemleri açıklamak ve her tarafından oluşturulan veriler için örnekler göstereceğiz.
GCaMP çevreleyen kalsiyum konsantrasyonu ile duyarlı olan değiştirilmiş bir yeşil floresan proteini (GFP) esas alınmaktadır. Bu, kalmodulin tarafından kalsiyum bağlayıcı etkili bir floresan teyit 2 içine GFP molekül getirir, öyle ki GFP füzyon ve kalsiyum yüksek afinite protein kalmodulin ile gerçekleştirilmektedir. Bu floroforlar yılında son gelişmeler bir kalsiyum düzeylerinin fizyolojik aralığı ve ~ 95 msn yükselme zamanı ve ~ 650 msn bozunma süresi 4 makul hızlı kinetiği üzerinde floresan yoğunluğu% 500'e varan artış ile olağanüstü sinyal boyutunu oluşturur. Nispeten kısa sürelerle (dakika) içinde, bu büyük sinyalleri düşük çözünürlüklü görüntüleme için izin (düşük büyütme) ve iyi huylu init verilen edebilirsinizial Bazal ölçüm, sürekli bazal veya karşılaştırmalı ölçümler için gerekliliğini inkâr.
Cameleon iki bağımsız kanal ya da dalgaboyu 1 ile karşılaştıran bir rasyometrik ölçümü üreten bir FRET tabanlı bir florofor olma avantajına sahiptir. Bir kalmodulin proteini ile bağlantılı iki ayrı floroforlar (mavi ve sarı-yayan floresan proteinleri, CFP ve YFP) oluşmaktadır. Karmaşık CFP heyecanlandıran mavi ışık (440 nm) ile aydınlatılır. Kalsiyum bağlama YFP (alıcı) için CFP (donör) floresan rezonans enerji transferi (FRET) artırılması ve CFP emisyon (480 nm) azaltmak ve YFP emisyon (535 nm) artırmak için neden birbirlerine daha yakın floroforlar getiriyor . Göreli kalsiyum seviyeleri YFP / CFP yoğunluk oranı olarak ölçülmüştür. Cameleon kinetiği ~ 1 sn yükselme zamanı ve ~ 3 sn 5 bir çürüme zaman için in vivo ölçülen GCaMP, bu daha yavaştır. Bununla birlikte,zıt hareket eden sinyallerin oran sinyali boyutunu artırır ve nedeniyle florofor konsantrasyon, hareket veya odak kayması ve ağartma değişiklikler mümkündür eşya bir sayı için dengeler.
Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere Eksojen probları ve C ile birlikte gerekli numune hazırlama çok inkâr elegans küçük şeffaf gövde basit geniş bir alan floresan kullanarak sağlam hayvanın içinde görüntüleme sağlar. Numune hazırlamada temel teknik zorluk güvenle hayvanların hareketsiz taşımaktadır. Farklı sık kullanılan teknikler avantaj ve dezavantajları ile her biri bir dizi vardır. Hayvanlar felç bir farmakolojik ajan kullanarak uygulamak kolaydır ve izin (Levamizol, ele geçirmek için kas dokusu sebep genellikle 6 kullanılan bir kolinerjik agonist) bir hazırlık birden hayvanların montaj. C. elegans da fiziksel olarak onları monte edilerek immobilize edilebilirsert% 10 agaroz 7, 8. Hayvan fizyolojisi üzerindeki bu etkisi en aza indirir, uzun süreli görüntüleme (saat) ve çoklu hayvan kurtarma sağlar ama daha teknik olarak zordur. Bu tekniklerin her ikisi hayvan (olan bir kapak slipi altında) için fiziksel erişimi kısıtlamak ve bu nedenle sadece belirli deneysel uyaranlara (örneğin ışık, ısı, elektrik alanı lazer ya da hasar gibi) ile birlikte kullanılabilir. Bu tür kimyasallar touch veya yönetim gibi fiziksel erişimi gereklidir uyaranlar için, birçok çalışma başarıyla C. yapıştırılmış yerde elegans (veterinerlik notu tutkal kullanarak) 9. Bu teknik olarak daha zordur, tek bir hayvan, hazırlık ve hayvan kurtarma izin vermez. Son olarak, çok sayıda mikroakışkan cihazlar fiziksel C. dizginlemek olduğu istihdam edilmiştir elegans, hayvan fizyolojisi koruyarak uyaranlara (cihazın tasarımına bağlı) birçoğuna maruz izin ve hayvanların hızlı değişim ve iyileşme sağlayabilir <sup> 10, 11. Ancak ve arayüz tasarımı, imalat ve uygulanmasında ek teknik beceri ve yetenekleri gerektirir. Sabitlenmiş hayvanlar aktivite ve uyaran olarak tepki genellikle duyusal ve internöron ölçülebilir. Motor nöronların Aktivite hareketli hayvanlarda görüntüleme için daha sofistike teknikler gerektirir. Burada farmakolojik paralyzation ve sert agaroz ile immobilizasyon iki en basit teknikler kullanılarak detaylı yöntemleri sunacak.
Burada sunulan yöntemler C. nöronal aktivite ve hücre fizyolojisi ölçmek için kullanılabilir elegans. Her bir örnek vereyim: bir dış elektrik alan için ASJ nöronun duyu yanıtı ölçmek için GCaMP kullanarak ve bir nöronun lazer hasara fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak. Bu örnekler floroforlar iki tip yararları ve sakıncaları göstermek ve sistem ile nelerin mümkün olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri yaygın C. kullanılmıştır elegans nörobiyoloji. Birçok grup bir elektrik alanına ASJ yanıtı burada gösterildiği gibi dış uyaranlara primer duyu nöronlarının yanıt incelemek için bu teknikler istihdam var. Tanınmış örnekler mekanik dokunma hissi, özel kimyasallar, sıcaklık ve elektrik alan 12, 16-19 içerir. Interneuron ve kas hücrelerinin aktivitesi uyarıcıya tepki olarak ve hayvan davranışı kontrol hem de izlen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Birkaç kişi bu yazıda anlatılan çalışmalarına katkıda. CVG deney düzeneği inşa ve LS, SHC ve CVG deneyleri yapılmaktadır. CVG ve SHC yazması yazdı. Tüm yazarlar sonrasında revizyon sürecinde yer aldı ve yazının son onaylı kopyası. Biz GCaMP suşu için Paul Sternberg ederim. Bu çalışmada kullanılan bazı nematod suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlandı. MATLAB görüntü analiz programı 18'de kullanılan uyarlanmıştır. Yazarlar Boston Üniversitesi ve Massachusetts Yaşam Bilimleri Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
