Summary

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Published: April 10, 2013
doi:

Summary

مع صغر الجسم التشريح العصبي شفافة موثقة جيدا، ومجموعة من التقنيات الجينية قابلة والكواشف،<em> C. ايليجانس</em> يجعل الكائن الحي النموذج المثالي لل<em> في الجسم الحي</em> التصوير باستخدام الخلايا العصبية بسيطة نسبيا، وانخفاض التكلفة التقنيات. نحن هنا وصف واحد التصوير داخل الخلايا العصبية سليمة باستخدام الحيوانات البالغة المشفرة وراثيا مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت.

Abstract

والديدان الخيطية دودة C. ايليجانس هو كائن النموذج المثالي لبسيطة نسبيا، والتصوير بتكلفة منخفضة الخلايا العصبية في الجسم الحي. جسمها شفافة صغيرة وبسيطة وجيدة تتسم الجهاز العصبي يسمح بتحديد والتصوير مضان من الخلايا العصبية داخل أي الحيوان سليمة. تقنيات بسيطة الشلل مع تأثير ضئيل على علم وظائف الأعضاء في الحيوان السماح الممتدة الوقت الفاصل بين التصوير. تطوير fluorophores الكالسيوم وراثيا ترميز حساسة مثل cameleon 1 و 2 تسمح GCaMP في التصوير المجراة من الكالسيوم العصبية تتعلق بكل علم وظائف الأعضاء والخلايا نشاط الخلايا العصبية. سلالات معدلة وراثيا معربا عن العديد من هذه الخلايا العصبية في fluorophores محددة متوفرة أو يمكن بناؤها باستخدام تقنيات راسخة. هنا، نحن تصف الإجراءات التفصيلية لقياس ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا العصبيه واحدة في الجسم الحي باستخدام كل GCaMP وcameleon. نناقش مزايا وdisadvantالأعمار من كلا فضلا عن أساليب مختلفة لإعداد العينات (تجميد الحيوانات) وتحليل الصور. وأخيرا، فإننا نقدم نتائج تجربتين: 1) عن طريق GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية لمحددة لمجال كهربائي خارجي و 2) عن طريق cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للخلية عصبية إلى أضرار الليزر الصدمة. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم مثل هذه على نطاق واسع في C. وقد تم تمديد ايليجانس والقياسات في الحيوانات التحرك بحرية، الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت والمقارنة بين خلفيات وراثية. C. ايليجانس يقدم نظام قوي ومرن لفي الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية مع أنظمة المزايا على نموذج آخر من البساطة الفنية والتكلفة.

Introduction

هنا نقدم طرق عملية لفي الجسم الحي التصوير الكالسيوم في C. الخلايا العصبية ايليجانس. تطوير fluorophores الكالسيوم الحساسة للترميز وراثيا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية يجعل C. ايليجانس نظام بسيط نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لقياس الفسيولوجيا العصبية والنشاط. ويتم التصوير لدينا مع المجهر المركب باستخدام معيار واسع المجال من التصوير مضان fluorophores المتاحة عموما. نقدم العديد من التقنيات المختلفة التي تستخدم fluorophores والاستعدادات عينة مختلفة، ومناقشة نقاط القوة والضعف لكل منها. وترد البيانات من التجارب ثم المثال الثاني. ويمكن الاطلاع ممتازة من الموارد الإضافية على التقنيات الموضحة هنا في WormBook، "تصوير نشاط الخلايا العصبية والعضلات" من قبل كير R.، ( http://www.wormbook.org ) 3.

فئتين الرئيسية للجينياويشيع استخدام ترميز أتوماتيكيا للصحفيين الفلورسنت الكالسيوم في C. ايليجانس: واحد GCaMP قناة وcameleon الحنق القائم. سنقوم بشرح أساليب وتظهر أمثلة للبيانات التي تم إنشاؤها بواسطة كل منهما.

ويستند GCaMP على بروتين الفلورية الخضراء تعديل (GFP) التي تعتبر حساسة لتركيز الكالسيوم المحيطة بها. ويتم إنجاز هذا عن طريق مزيج من GFP وتقارب الكالسيوم عالية البروتين كالمودولين، على ان يكون ملزما من الكالسيوم عن طريق كالمودولين يرتفع جزيء GFP في تأكيد على كفاءة الفلورسنت 2. التطورات الأخيرة في هذه fluorophores توليد إشارة استثنائية مع زيادة حجم ما يصل الى 500٪ في كثافة مضان على نطاق والفسيولوجية للمستويات الكالسيوم وحركية بسرعة معقولة من 95 مللي ثانية ~ الوقت وارتفاع ~ تسوس ميللي ثانية 650 مرة 4. على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا (دقائق)، يمكن لهذه الإشارات كبيرة تسمح للتصوير دقة أقل (أقل التكبير)، ونظرا لحسن تصرف الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم قياس خط الأساس، ينفي ضرورة أساسية متصلة أو قياسات نسبية.

Cameleon له ميزة كونه fluorophore الحنق على أساس أن يولد قياس ratiometric المقارنة بين اثنين من قنوات مستقلة أو موجات 1. وهي تتألف من اثنين fluorophores منفصلة (البروتينات الفلورية سماوي والصفراء التي ينبعث منها، وYFP CFP) ويربطها به كالمودولين بروتين. يضيء مجمع مع الضوء الأزرق (440 نانومتر) التي يثير CFP. ملزمة من الكالسيوم يرتفع fluorophores أقرب معا، وزيادة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) من CFP (المانحة) إلى YFP (متقبل) والتسبب في انبعاث CFP (480 نانومتر) لتقليل الانبعاثات وYFP (535 نانومتر) لزيادة . يتم قياس مستويات الكالسيوم النسبية بأنه نسبة كثافة YFP / CFP. حركية Cameleon تكون أبطأ من تلك التي GCaMP، وتقاس في الجسم الحي لقضاء وقت صعود ثانية 1 ~ وزمن اضمحلال 3 ~ 5 ثوانى. ومع ذلك،نسبة إشارات تتحرك معاكس يزيد من حجم إشارة ويعوض عن عدد من القطع الأثرية ممكن نظرا للتغيرات في حركة fluorophore، أو الانجراف التركيز التركيز والتبييض.

للصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا ينفي الكثير من إعداد العينات المطلوبة مع تحقيقات تدار خارجيا وC. ايليجانس الجسم شفاف يسمح التصوير داخل صغيرة الحيوان سليمة باستخدام بسيطة مضان حقل واسع. التحدي الرئيسي في إعداد العينات التقنية لذلك لشل حركة الحيوانات بأمان. هناك عدد من التقنيات المختلفة المستخدمة لكل منها مزايا وعيوب. استخدام وكيل الدوائية على شل الحيوانات من السهل لتنفيذ ويسمح للتصاعد من الحيوانات متعددة على واحد إعداد (الليفاميزول، ناهض الكولينية التي تسبب الأنسجة العضلية للاستيلاء وعادة ما تستخدم 6). C. ويمكن أيضا أن يجمد ايليجانس الجسدي من قبل متزايدة منهمعلى تصلب الاغاروز 10٪ 7 و 8. يقلل هذا التأثير على علم وظائف الأعضاء الحيوانية، ويسمح على المدى الطويل التصوير (ساعة) والانتعاش من الحيوانات متعددة ولكن هو أكثر صعوبة من الناحية الفنية. كل من هذه التقنيات تقييد الوصول الفعلي إلى الحيوانات (التي هي تحت الغطاء زلة) وبالتالي يمكن أن تستخدم إلا مع المحفزات التجريبية معينة (مثل الضوء، حقل، ودرجة الحرارة الكهربائية أو تلف ليزر). لالمحفزات التي تتطلب الوصول المادي، مثل اللمس أو إدارة المواد الكيميائية، والعديد من الدراسات لصقها بنجاح C. ايليجانس في مكان (باستخدام الغراء البيطرية الصف) 9. هذا هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، هو إعداد حيوان واحد، ولا تسمح الانتعاش الحيوان. وأخيرا، فقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك العديدة التي تقيد جسديا C. ايليجانس، يمكن الحفاظ على فسيولوجيا الحيوان، مما يسمح التعرض لمعظم أنواع المنبهات (اعتمادا على تصميم الجهاز) وتمكين التبادل السريع والتعافي من الحيوانات <sup> 10 و 11. لكن على microfluidics تتطلب مهارات فنية وقدرات إضافية في تصنيع وتصميم وتنفيذ. يمكن في النشاط والتحفيز يجمد الحيوانات عموما يمكن قياس استجابة في الحسية وinterneurons. نشاط الخلايا العصبية الحركية يتطلب تقنيات أكثر تطورا لتصوير الحيوانات في الحركة. هنا سنقدم طرق مفصلة توظيف الطريقتين الأكثر مباشرة من paralyzation الدوائية والشلل مع الاغاروز شديدة.

يمكن استخدام الأساليب المعروضة هنا لقياس نشاط الخلايا العصبية وعلم وظائف الأعضاء في الخلية C. ايليجانس. نعطي مثالا على كل منها: استخدام GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية من ASJ إلى حقل كهربائي خارجي، واستخدام cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للضرر الليزر من الخلايا العصبية. هذه الأمثلة تبين مزايا وعيوب هذين النوعين من fluorophores وتوضيح ما هو ممكن مع النظام.

Protocol

1. إعداد البصرية استخدام المجهر المركب القياسية مع قدرات التصوير epifluorescence. نستخدم الكسوف نيكون تي U مقلوب المجهر مع اضاءة HG Intensilight. للحصول على أفضل صورة وجودة الإشارة استخدام تضخم عالية، وار?…

Representative Results

هنا نقدم نتائج تجربتين منفصلتين. أول توظف GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية لمن الحسية محددة لتحفيز خارجي تعريف، وإعطاء مثال جيد على كيفية استخدام الكالسيوم للصحفيين الفلورسنت لرصد نشاط الخلايا العصبية في بصريا C. سليمة ايليجانس. والثاني يعمل cameleon لقياس ال…

Discussion

وقد تم ترميز مؤشرات الكالسيوم وراثيا المستخدمة على نطاق واسع في C. ايليجانس بيولوجيا الأعصاب. استخدمت هذه التقنيات فئات عديدة لدراسة استجابة الخلايا العصبية الحسية الأولية للمؤثرات الخارجية كما هو موضح هنا مع الاستجابة لASJ مجال كهربائي. ومن الأمثلة البارزة الإ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ساهم عدة أشخاص في أعمال وصفها في هذه الورقة. بنيت CVG الإعداد التجريبية، وLS، SHC، وCVG إجراء التجارب. كتب CVG وSHC المخطوطة. جميع المؤلفين شارك بعد ذلك في عملية مراجعة والموافقة على النسخة النهائية من المخطوط. نشكر بول ستيرنبرغ لسلالة GCaMP. وقدمت بعض سلالات النيماتودا المستخدمة في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC)، الذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). تم تعديل برنامج MATLAB تحليل الصور عن تلك المستخدمة في 18. ويؤيد الكتاب من جامعة بوسطن وماساتشوستس مركز العلوم الحياة.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Eclipse Ti-U inverted
microscope
Nikon    
Intensilight HG Illuminator Nikon C-HGFI Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil Nikon    
Optical table or 3’X3′ optical
grade breadboard
Thor Labs   If an optical table is not used an
optical grade breadboard on a
solid laboratory bench should
suffice.
Clara Interline Camera Andor
Technology
  High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission Chroma Technology
Corp.
41015 GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm Chroma D440/20x EX excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm
longpass
Chroma 455DCLP BS microscope dichroic for cameleon
imaging
Dichroic mirror > 515 nm
longpass
Chroma 515DCLP BS dichroic mirror for cameleon
imaging
Filter 535 +/- 15 nm Chroma D535/30m EM YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm Chroma D485/40m EM CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat Thor Labs AC508-200-A1 Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror Thor Labs ME2S-P01 FRET optics (2)
NGM buffer      
Levamisole Sigma    
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 08691-10, 2.5% by
volume, 50 nm
diameter
polystyrene nanoparticles for C.
elegans immobilization
Transgenic strain, Strain
gpa-9::GCaMP3(in pha-1;
him-5 bkg)
Sternberg Lab Strain PS6388  
Transgenic strain, mec-
4::YC3.60
Gabel Lab Strain CG1B  

References

  1. Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
  3. Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
  6. Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
  7. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
  8. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
  9. Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  10. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  11. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  12. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
  13. Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
  14. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  15. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
  16. Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
  17. Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
  18. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
  19. Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
  20. Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
  21. Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).

Play Video

Cite This Article
Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. (74), e50357, doi:10.3791/50357 (2013).

View Video