Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

A capacidade do cérebro de mudar em resposta a experiência é essencial para a função saudável do cérebro, e anomalias no presente processo contribuem para uma variedade de desordens cerebrais ^1,2. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais os circuitos cerebrais reagem a experiência de um animal requer a capacidade de monitorar as alterações dependentes da experiência molecular em um dado conjunto de neurónios, ao longo de um período de tempo prolongado, em que o animal vivo. Embora a experiência e atividade neural associada é conhecido por desencadear mudanças de expressão gênica em neurônios ^1,2, a maioria dos métodos para detectar tais mudanças não permitir a observação repetida dos mesmos neurônios durante vários dias ou não tem resolução suficiente para observar neurônios individuais ^{3 , 4.} Aqui, descrevemos um método que combina in vivo de dois fótons de microscopia, com um repórter fluorescente geneticamente codificado para rastrear experiência dependentes de mudanças de expressão gênica em neurônios corticais individuais sobre o claro do dia-a-dia experiência.

Uma das bem estabelecidas experiência dependentes de genes é regulada Atividade proteína associada citoesqueleto (Arco) ^5,6. A transcrição do arco é rápida e altamente induzida pela intensificação da actividade neuronal ^3, e do seu produto de proteína regula a endocitose de receptores de glutamato e de longo prazo de plasticidade sináptica ^7. A expressão do arco tem sido amplamente utilizada como um marcador molecular para mapear os circuitos neuronais envolvidas em comportamentos específicos ^3. Na maioria destes estudos, a expressão Arc foi detectada por hibridação in situ ou imuno-histoquímica em secções de cérebro fixos. Embora esses métodos revelaram que a expressão do arco foi localizada para um subconjunto de neurónios excitatórios após experiências comportamentais, como os padrões de expressão celular do arco pode mudar com múltiplos episódios de experiências repetidas ou distintivo mais dias não foi investigada.

ntent "> in vivo de dois fótons de microscopia oferece uma poderosa forma de examinar a experiência adquirida dependentes de alterações celulares no cérebro vivo ^8,9. Para permitir a análise de expressão Arc em neurônios vivos por dois fótons de microscopia, que anteriormente gerou um knock- na linha de rato em que um repórter GFP é colocado sob o controle do promotor endógeno do arco ^10. Este protocolo descreve as preparações cirúrgicas e procedimentos de imagiologia de seguimento experiência dependentes de padrões de expressão de Arc-GFP em conjuntos neuronais do animal vivo. Neste método , crónicas janelas cranianas foram primeiro implantado em ratinhos Arc-GFP nas regiões corticais de interesse. Estes animais foram então repetidamente fotografada por dois fotões microscopia após desejados paradigmas de comportamento ao longo de vários dias. Este método pode ser geralmente aplicável a animais portadores outros repórteres fluorescentes de experiência dependentes de alterações moleculares ^4.