In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

De hersenen het vermogen te veranderen in reactie op ervaring is essentieel voor gezonde hersenfunctie, en afwijkingen in dit proces bijdragen van verschillende hersenaandoeningen ^1,2. Om een ​​beter begrip van de mechanismen waarmee hersencircuits reageren bieden een dier vereist het vermogen om de ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in een bepaalde set van neuronen monitoren gedurende een langere periode, in het levende dier. De ervaring en bijbehorende neurale activiteit bekend genexpressie veranderingen in neuronen ^1,2 veroorzaken ^de meeste methoden om dergelijke veranderingen te detecteren niet mogelijk herhaalde waarneming van dezelfde neuronen over meerdere dagen of niet voldoende resolutie om acht individuele neuronen ^{3 , 4.} We beschrijven een methode die in vivo twee-foton microscopie combineert met een genetisch gecodeerd fluorescerende reporter ervaring-afhankelijke genexpressie in de individuele corticale neuronen volgen de loop van dag tot dag bieden.

Een van de gevestigde ervaring-afhankelijke genen is Activity-gereguleerde cytoskelet geassocieerde eiwit (Arc) ^5,6. De transcriptie van Arc is zeer snel en zeer geïnduceerd door verscherpte neuronale activiteit ³ en het eiwitproduct reguleert de endocytose van glutamaatreceptoren en langdurige synaptische plasticiteit ^7. De expressie van Arc is op grote schaal gebruikt als een moleculaire marker om neuronale circuits betrokken bij specifieke gedrag ³ kaart. In de meeste van deze studies werd Arc expressie gedetecteerd door in situ hybridisatie of immunohistochemie in vaste hersencoupes. Hoewel deze methoden blijkt dat de expressie van Arc werd gelokaliseerd op een subset van neuronen na exciterend gedrag bieden, hoe de patronen van cellulaire Arc expressie kan veranderen met meerdere episodes van herhaalde onderscheidend ervaringen over dagen niet onderzocht.

ntent "> In vivo twee-foton microscopie een krachtige manier om ervaring op-afhankelijke cellulaire veranderingen in het levende brein ^8,9 onderzoeken biedt. Om het onderzoek van de Arc expressie in levende neuronen mogelijk te maken door twee-foton microscopie, we eerder genereerde een knock- in muizenlijn waarin een GFP reporter wordt geplaatst onder de controle van de endogene promoter Arc ^10. Dit protocol beschrijft chirurgische preparaten en imaging procedures voor het bijhouden bieden afhankelijke Arc-GFP expressie patronen in neuronale ensembles in het levende dier. In deze werkwijze , chronische craniale ramen werden eerst geïmplanteerd in Arc-GFP muizen over de corticale gebieden plaats. Deze dieren werden vervolgens herhaaldelijk afgebeeld door twee-foton microscopie na gewenste gedragsparadigma's in de loop van enkele dagen. Deze methode kan algemeen voor dieren met andere fluorescerende verslaggevers van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen ^4.