In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח
Summary
שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.<em> In vivo</emשיטת הדמיה> שני פוטונים מתוארת כאן, המאפשרת מעקב אחר שינויים מולקולריים כאלה בנוירונים בקליפת המוח בודדים באמצעות כתבים מקודדים גנטי.
Abstract
יכולתו של המוח להשתנות בתגובה לניסיון חיונית לתפקוד המוח בריא, והליקויים בתהליך זה תורמים למגוון של הפרעות 1,2 המוח. כדי להבין טובים יותר את המנגנונים שבאמצעותם מעגלים חשמליים במוח מגיבים לניסיון של בעל חיים דורש את היכולת לעקוב אחר השינויים המולקולריים חוויה התלויה במערך נתון של נוירונים, על פני תקופה ממושכת של זמן, בחי. למרות הניסיון והפעילות עצבית המשויך לו ידוע לגרום לשינויים בביטוי גני נוירונים 1,2, רוב השיטות כדי לזהות שינויים כאלה אינם מאפשרים התבוננות חוזרת ונשנית של אותם נוירונים מעל ימים מרובים או אין לך רזולוציה מספיקה להתבונן נוירונים בודדים 3 , 4. כאן, אנו מתארים שיטה שמשלבת בvivo מיקרוסקופ שני פוטונים עם כתב ניאון מקודד גנטי כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גני חוויה תלויות בנוירונים בקליפת המוח בודדים מעל במהלך ניסיוני היום יום.
אחד מהגנים ומבוססי ניסיון התלויים הוא חלבון פעילות מוסדרת cytoskeletal המשויך (ארק) 5,6. התעתיק של Arc הוא במהירות וביותר הנגרם על ידי פעילות עצבית מוגברת 3, והמוצר שלה החלבון מסדיר אנדוציטוזה של קולטני גלוטמט ופלסטיות ארוכת טווח הסינפטי 7. הביטוי 'ארק כבר בשימוש נרחב כסמן מולקולרי למיפוי מעגלים עצביים מעורבים בהתנהגויות ספציפיות 3. במרבית המחקרים אלה, ביטוי ארק זוהה על ידי כלאה באתרו או אימונוהיסטוכימיה בחלקי מוח קבועים. למרות השיטות האלה גילו כי הביטוי 'ארק היה מקומי לקבוצת משנה של הנוירונים מעוררים לאחר ניסיון התנהגותי, איך את הדפוסים הסלולר של ביטוי ארק עשויים להשתנות עם אפיזודות מרובות של חוויות חוזרות או ייחודיות מעל ימים לא נחקר.
ntent "> בחי מיקרוסקופ שני פוטונים מציע דרך רבה עצמה כדי לבחון שינויים תאיים חוויה תלויה במוח החי 8,9. כדי לאפשר בחינה של ביטוי ארק נוירונים בחיים על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים, יצרו דפיקה בעבר בתור עכבר שבכתב GFP מוצב תחת השליטה של אמרגן ארק אנדוגני 10. פרוטוקול זה מתאר את הכנות כירורגיות ונהלי הדמיה למעקב אחר דפוסי ביטוי Arc-GFP חוויה תלוי בהרכבים עצביים בחי. בשיטה זו , חלונות גולגולת כרוניים היו מושתלים הראשון בעכברי Arc-GFP מעל אזורי קליפת הריבית. אלה חיות אז צלמו שוב ושוב על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים לאחר פרדיגמות התנהגות רצויה במשך כמה ימים. שיטה זו עשויה להיות רלוונטית לכלל בעלי חי נושאים כתבי ניאון אחרים של שינויים מולקולריים ניסיון תלויים 4.Protocol
Representative Results
Discussion
בשיטת הדמית vivo המתוארת כאן מאפשר בדיקה חוזרת של שינויי ביטוי גני Arc באותם סטים של תאי עצב מעל ימים מרובים בחי. זה הוא שיטה יעילה ותכליתית כדי להשיג מידע על דינמיקה מולקולרית הקשורים לפלסטיות עצבית בנוירונים בודדים בתגובה לחוויות התנהגותיות שונות. שיטות סטנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ל 'Belluscio לציוד הסרטת ניתוח, ד' קוון לצילום סיוע, ק יו לעריכת וידאו סיוע, וק מקלאוד לכל מוסיקת הרקע. ק"ו מודה לתמיכה הנדיבה של אגף NIMH של תוכניות מחקר מו"פ אזרחיות והגנים, קוגניציה ותכנית פסיכוזה. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית מחקר NIMH ביצוע העצמית (VC, י.י., SMKW) והחטיבה של תכנית מחקר הקלינית והביולוגית של בין חומות NIAAA (VC, RMC, DML).
Materials
| Name of the Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
- Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
- Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
- Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
- Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
- Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
- Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
- Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
- Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
- Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
