Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

La diffusa, intracellulare obbligato, protozoo parassita Toxoplasma gondii causa malattia opportunistica in pazienti immuno-compromessi e causa difetti di nascita al momento dell'infezione congenita. Il ciclo di replica litico è caratterizzato da tre fasi: 1. invasione attiva di una cellula ospite nucleata; 2. la replicazione all'interno della cellula ospite; 3. uscita attiva dalla cellula ospite. Il meccanismo di uscita è sempre più apprezzato come un processo unico e altamente regolamentato, che è ancora poco conosciuta a livello molecolare. I percorsi di segnalazione sottostanti uscita sono stati caratterizzati mediante l'uso di agenti farmacologici che agiscono su diversi aspetti dei percorsi ^1-5. Come tali, diversi inneschi indipendenti di uscita sono stati identificati quali convergono tutti rilascio intracellulare di Ca ^{2 +,} un segnale che è anche critica per l'invasione della cellula ospite ^6-8. Questa intuizione ha informato di un approccio del gene candidato che ha portato alla identizione degli impianti come il calcio proteina chinasi dipendente (CDPK) coinvolti in uscita ^9. Inoltre, molti recenti scoperte in uscita comprensione sono state realizzate con (chimica) approcci genetici ^10-12. Per combinare la ricchezza di informazioni farmacologica con l'accessibilità crescente genetica di Toxoplasma abbiamo recentemente istituito una schermata che permette l'arricchimento per i mutanti parassita con un difetto della cellula ospite in uscita ^13. Anche se mutagenesi chimica utilizzando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o etile metanosolfonato (EMS) è stata utilizzata per decenni nello studio della biologia Toxoplasma ^11,14,15, solo recentemente ha la mappatura genetica delle mutazioni alla base dei fenotipi diventano routine ^{16 -18.} Inoltre, generando termosensibili mutanti, processi essenziali possono essere sezionati e le sottostanti direttamente geni identificati. Questi mutanti comportano come tipo selvatico sotto la temperatura permissiva (35 ° C), ma non proliferate alla temperatura restrittivo (40 ° C) come risultato della mutazione in questione. Qui illustrano un nuovo metodo di screening per isolare mutanti fenotipica con un sensibile alla temperatura fenotipo uscita ^13. La sfida per schermi egress è quello di separare egressed da non egressed parassiti, che è complicata dal rapido re-invasione e l'adesività generale dei parassiti per le cellule ospiti. Una schermata di uscita precedentemente stabilito si basava su una serie complessa di passaggi biotinilazione per separare intracellulare dai parassiti extracellulari ^11. Questo metodo inoltre non generare mutanti condizionali conseguente fenotipi deboli. Il metodo qui descritto supera il forte attaccamento di egressing parassiti includendo un concorrente glicano, solfato di destrano (DS), che impedisce parassiti di attaccarsi alla cellula ospite ^19. Inoltre, i parassiti extracellulari sono specificamente ucciso da pirrolidina ditiocarbammato (PDTC), che lascia i parassiti intracellulariilleso ^20. Pertanto, con una nuova schermata fenotipica per isolare specificamente parassiti mutanti con difetti in uscita indotta, il potere della genetica possono ora essere pienamente dispiegato per svelare i meccanismi molecolari alla base della cellula ospite uscita.