מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות
Summary
קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של כמה<em> Toxoplasma</em> Egresses מהתא המארח שלה. הפרוטוקולים ניתנים כימית mutagenize טפילים, להעשיר את מוטנטים עם פגמים יציאה יזומה, ולאמת את הפנוטיפ של מוטציות משובטים.
Abstract
נפוצה, מחייבים תאיים, protozoan הטפיל Toxoplasma gondii גורם למחלות אופורטוניסטית ב חיסונית שנפרצו חולים וגורם למומים מולדים עם זיהום מולד. מחזור שכפול ממס מתאפיינת בשלושה שלבים: 1. הפלישה פעיל של תא פונדקאי גרעיני: 2. שכפול בתוך התא המארח, 3. יציאה פעילה מן התא המארח. מנגנון של יציאה היא יותר ויותר להיות מוערך כתהליך, ייחודי פיקוח הדוק, אשר עדיין ממעטים להבין ברמה המולקולרית. מסלולי איתות יציאה בבסיס אופיינו באמצעות סוכני פרמקולוגיים הפועלים על היבטים שונים של מסלולים 1-5. לפיכך, גורמים עצמאיים שונים של יציאה זוהו שכל להתכנס על שחרורו של Ca 2 + תאיים, סימן שהוא גם קריטי עבור הפלישה התא המארח 6-8. תובנה זו הודיע הגן המועמד הגישה שהוביל identiאחת מהבעיות הנגזרות מהחלוקה של הצמח כמו סידן קינאז החלבון תלויה (CDPK) מעורב יציאה 9. בנוסף, פריצות הדרך האחרונות מספר יציאה הבנה נעשו באמצעות (כימי) גישות גנטיות 10-12. לשלב שפע של מידע תרופתי עם נגישות גנטי גדל והולך של Toxoplasma לנו לאחרונה הוקמה מסך המאפשר העשרה מוטציות טפיל עם פגם יציאה התא המארח 13. למרות mutagenesis כימי באמצעות N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) או אתיל methanesulfonate (EMS) שימש במשך עשרות שנים בחקר הביולוגיה Toxoplasma 11,14,15, רק לאחרונה יש מיפוי גנטי של מוטציות שבבסיס פנוטיפים הופכים לשגרה 16 -18. יתר על כן, על ידי יצירת מוטציות רגישות טמפרטורה, תהליכים חיוניים ניתן גזור ואת הגנים הבסיסיים מזוהה באופן ישיר. מוטציות אלה מתנהגים כמו wild-type תחת טמפרטורה מתירנית (35 ° C), אבל לא מצליחים עמ 'roliferate בטמפרטורת כובל (40 ° C) כתוצאה של מוטציה הנדון. כאן אנו להמחיש שיטה חדשה ההקרנה פנוטיפי לבודד מוטנטים עם פנוטיפ הטמפרטורה רגיש יציאה 13. האתגר עבור מסכי היציאה היא להפריד egressed מן הלא egressed טפילים, אשר מורכבת על ידי מהיר מחדש הפלישה הדביקות הכללי של טפילים לתאי המארח. מסך יציאה הוקמה בעבר היה מבוסס על סדרה של צעדים מסורבלת biotinylation להפריד בין תאיים טפילים תאיים 11. שיטה זו גם לא ליצור מוטנטים מותנים וכתוצאה מכך פנוטיפים חלשים. השיטה המתוארת כאן מתגבר מצורף חזקה של egressing טפילים על ידי הכללת מתחרה glycan, סולפט dextran (DS), המונע טפילים יידבקו אל התא המארח 19. יתר על כן, טפילים תאיים נהרגים במיוחד את ידי pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), מה שמשאיר טפילים תאייםללא פגע 20. לכן, עם מסך פנוטיפי חדש במיוחד לבודד מוטנטים טפיל עם פגמים יציאה יזומה, כוחה של הגנטיקה כעת ניתן לפרוס באופן מלא לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התא המארח יציאה.
Protocol
Discussion
פרוטוקול תיאר מספק שיטה יעילה לבודד מוטנטים Toxoplasma עם מום יציאה. אנחנו מבודדים בהצלחה מוטציות לאורך השלבים השונים של מסלול יציאה, שחלקם יש פנוטיפ הפלישה כפול 13. השפעה על הפלישה ניתן לקבוע באמצעות מה שמכונה אדום ירוק assay, אשר מבדיל בין פלש ללא פלש טפילים י?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי איגוד הלב האמריקני המדען פיתוח גרנט 0635480N ואת המכונים הלאומיים לבריאות מענק מחקר AI081220. BIC נתמך על ידי קרן עין האבירים הטמפלרים מענק מחקר.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher & Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective |
HBSSc (according to Black et al.11):
- 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
- 100 μl 1M MgCl2 (100 mM end)
- 100 μl 1M CaCl2 (100 mM end)
- 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
- 84 mg NaHCO3 (10 mM end)
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
