מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה לייעל את זיהוי immunofluorescent של קולטן אסטרוגן α (ERα) על פרוסות עכברוש pial עורקים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי immunofluorescent.
רבים מן ההשפעות של אסטרוגן על תגובתיות כלי הדם מתווכות דרך האינטראקציה עם קולטני אסטרוגן 1, 2, 3. אמנם לשתי תת סוגים קיימים (קולטן אסטרוגן α ו β), קולטן אסטרוגן α זוהתה השריר הן חלק בתאי האנדותל של מגזרים עורקי pial באמצעות מכתים פלורסנט בשילוב עם לייזר confocal מיקרוסקופיית 4. יתר על כן, ER-α נמצא הגרעינים ואת בציטופלסמה של basilar העורקים חולדה 5. הקולטנים נמצאים בשפע לזרוח באור בהיר, אבל ברור להדמיה של קבוצות נפרדות של קולטנים קשה כנראה עקב המספרים ממוקם שכבות תאים רבים של קטעי כלי pial. בנוסף, דיווחים רבים תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical יחד עם מיקרוסקופיה פרט confocal גרוע בדרישות קריטי עבור שעתוק של ניסויים 6. מטרתנו במאמר זה היא לתאר טכניקה פשוטה כדי לייעל tהוא מכתים ויזואליזציה של ER-α באמצעות חתך פרוסות arterioles pial לקבל מן המוח חולדה ממין נקבה. אנחנו הראשונים perfuse חולדות עם אוונס כחול צבע לזהות בקלות העורקים משטח pial שבו אנו לבודד תחת מיקרוסקופ לנתח. השימוש cryostat לחתוך 8 חתכים מיקרומטר העורקים מאפשרת לנו להשיג חלקים לכלי כל כך רזה כי מטוסים כלי שיט שונים דמיינו יותר בבירור. חיתוך לרוחב כלי השיט, במקום השימוש קטע כלי קטן יש את היתרון של צפייה קלה יותר של שכבות השריר אנדותל וחלק. בנוסף, השימוש של מיקרוסקופ דיגיטלי עם תוכנה immunofluorescent עומק המורחבת מייצרת תמונות ברורות של 10-12 מטוסים כלי שיט שונים הוא יקר פחות מאשר השימוש במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה.
בעבר הראינו כי לאחר פגיעה מוחית העולמי איסכמי חולף יכולת העורק pial לשנות בקוטר בתגובה שניהם vasodilators 7, 8 ו 9 vasoconstrictors מדוכא ניכר בחולדות ovariectomized צעירים. גודש אסטרוגן כרונית משחזר התגובות וזומוטורים 7-9. יתר על כן, האסטרוגן עיכוב הופכת את ההשפעות המיטיבות של אסטרוגן על יכולת pial עורק vasodilatory 10 מוביל אותנו לשאלה אם לטווח ארוך דלדול אסטרוגן משפיע על ER-α הצפיפות cerebrovasculature. תכננו להשתמש בשילוב עם תיוג immunofluorescent המערבי סופג כדי להעריך את השינויים בביטוי ER-α בתגובה דלדול אסטרוגן כרונית. כי היו לנו כמה קשיים להדמיה של קבוצות נפרדות של קולטנים שינינו את השיטה שבה אנחנו מדגימים כאן. לכן, המטרה העיקרית שלנו במחקר זה היה הראשון לפתח שיטה פשוטה יחסית, כדי לייעל את הראייהשנפלו על הקרקע הפורייה של קולטנים arterioles pial. בהסכם עם מספר דיווחים 6,11,12 מצאנו לנכון לבצע התאמות עבור סוג של רקמה היינו חיטוט, עובי המדגם, התפלגות ER-α בתוך כלי, כמו גם את מידת הלא ספציפית מחייב .
השיטה שלנו מאוד יעיל כדי להמחיש את נוכחותו של ER-α בתוך פרוסות כלי pial. אבל כפי שאחרים ציינו בעבר את השימוש המוצלח של שיטות אלו תלויה מאוד ספציפיות ועל ריכוזים של הנוגדנים, את מיקומו subcellular של חלבונים של קיבוע הריבית, ופרוטוקולים חסימת וטיפול ברקמה 12. לפני ויזואליזציה של כלי ההכנות שלנו בילינו זמן לעבוד על כל אלה משתנים. יש לנו הדגיש כמה אנחנו צריכים לשנות כמה הגישה שלנו במאמר זה.
יצאנו באופן אופטימלי לדמיין ER-α ב arterioles pial וזה הציג כמה אתגרים.ראשית, הגודל הממוצע של העורקים עכברוש pial הוא בין 35-50 מיקרומטר ביצוע בידוד והסרה ממשטח המוח מסובך במקצת. מצאנו כי זלוף עם אוונס כחול לצבוע לפני להקריב עושה דיסקציה של העורקים קל. כחול של אוון יכול להשפיע הקרינה, אבל אנחנו מרגישים את היתרון של שימוש לצבוע עולים חסרונות קלים שלה. בפרוטוקול שלנו הכלים נשטפים מספר פעמים. זה ממזער את צבען שיורית הכלים ומקטין את ההשפעות האפשריות של צבע על הקרינה. קושי נוסף נתקלנו היה עובי של המגזרים כלי pial עשה ויזואליזציה ברורה של קולטנים קשה. בנוסף, לא יכולנו לקבל תמונות ברורות במיוחד, כנראה בגלל העובדה ER-α היו פזורים מספר שכבות תאים. ניסינו לעבוד עם פרוסות כלי האורך (כמו אחרים), אך בשל גודל pial קטן היה קשה להתמודד עם הכלים למנוע פיתול של כלי בעת הרכבהבשקופיות גם באמצעות מיקרוסקופ. לבסוף, אנו שונה בהצלחה הטכניקה שלנו באמצעות cryostat חיתוך כלי צולבות חכם ל -8 טבעות מיקרומטר עבה. הטבעות יותר קל לטפל וכמה יכול להיות מותקן בשקופית אחת.
לאחר שרכשנו את כלי הרגשנו צורך לבדוק את האפקטיביות של ההבזק הראשון מקפיא את הרקמה אז תיקון כלי כפי שהוצע על ידי Danseshatalb ושותפים 11. אמנם מצאנו immunofluorescence רקע שולית פחות, אנחנו גם ציין כי הקולטנים מוכתמים פחות אינטנסיבי עושה ויזואליזציה של קולטנים קשה יותר. כתוצאה מכך, אנו מעדיפים הראשון להקפיא את המוח כולו לאחסן עד הצורך (בדרך כלל בין 1-2 חודשים). לאחר מכן לשלוף את כלי כמתואר ולתקן את כלי לפני חיתוך עם cryostat. כפי שאנו מראים כאן.
אחת היא צעד הכרחי כדי להפעיל פקדי עם ראשוני והן משני הנוגדנים בנפרדכדי לקבוע הספציפיות immunofluorescence רקע. קולטן אסטרוגן α נוגדנים יכול להיות קשה לעבוד איתו. למעשה, ניסינו 3 נוגדנים העיקרי שונים (1 ו 2 חד שבטיים polyclonal) לפני שאנחנו מרוצים ההצלחה של מכתים הקולטן שלנו. במסגרת בקרות שלנו לאמת תחילה את הספציפיות של הנוגדן הראשוני על ידי השמטה של תוספת של הנוגדן הראשוני. איור 2 ד מציג את כלי בלי נוגדן ראשוני. אין מכתים ופשוט אות הרקע מעט. מאז הנוגדן העיקרי הוא polyclonal, יש כמה כתמים מפוזר שאינו ספציפי ברקע. שנית, הוספנו את הנוגדן הראשוני, אך לא את הנוגדן משני (איור 2E). ניתן לראות מרווח יפה המייצג את autofluoresence לאורך גבולות אנדותל של כלי. זה עולה בקנה אחד עם עבודתו של דן וחבריו 5. עם זאת, לא נקודות קטנות של immunofluorescence המייצגים ER-α, ולא נ"צ הופעה פרטניתlecting נוכחות של קולטנים רבים ניתן להבחין ללא שילוב של שני נוגדנים ראשוניים ומשניים. ציינו דפוס מובהק של autofluoresence בשולי האנדותל של כלי הדם. אלו בדיקות עצמאיות עבור סגוליות נוגדנים חשובים כפי שהם מאשרים את הספציפיות של הנוגדן עבור ER-α לבין נוגדנים משני נקשר הראשי.
לסיכום, כפי שהוכח על ידי אחרים 4, 5 כלי הדם במוח מכילים מספר רב של ER-α תת סוג הקולטנים. בידיים שלנו, הכנת 8μm פרוסות חתך צלב מן העורקים pial מבודד משפר מכתים ויזואליזציה של הקולטנים. שיטות מסורתיות להשתמש מיקרוסקופיה confocal לבחון את הדגימות. לאחר היכולת להציג קטעי אופטי סדרתי מתוך דגימות עבה היא יתרון חשוב של מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, רכישה של מיקרוסקופ confocal טוב יכול להיות מאוד יקר. באמצעות תוכנה מורחבת (EDF) עומק, מצאנו כייכול להפחית את עלויות הציוד שלנו. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם EDF השגנו תמונות ברורות והם מסוגלים לדמיין pial עורקי ER-α בכמה רמות באמצעות Z-ערימות. יתרון משמעותי של התוכנה EDF היא שזה מאפשר לכידת תמונה באופן יעיל ליצור תמונה 3-D מן התמונות. עבור מעבדות שאין להם גישה מיקרוסקופ confocal או הקרנות לרכוש אחד מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיגיטלי עם תוכנה הופקעו עשויה להיות אפשרות מעשית פחות יקר בהתאם המטרות של החוקר.
The authors have nothing to disclose.
העבודה על פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות R01-NR5339 ואוניברסיטת שירותי במדים של למדעי הבריאות, R061LD.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
EVANS BLUE | Sigma | E-2129 |
PBS 10X | Sigma | P-5493 |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 |
Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 |
Triton X-100 | Sigma | T9284 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 |
ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz | H-184 |
Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 |
Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI |
Vector Lab | H-1200 |