Het doel van dit artikel is om een methode aan te tonen immunofluorescentie detectie van oestrogeen receptor-α (ERα) in ratten pial arteriële plakken met behulp van een digitale immunofluorescentie microscoop te optimaliseren.
Veel van de effecten van oestrogeen op vasculaire reactiviteit worden gemedieerd door de interactie met oestrogeen-receptoren 1, 2, 3. Hoewel de twee sub-types bestaan (oestrogeen receptor-α en β), heeft oestrogeen receptor-α geïdentificeerd in zowel de gladde spieren en in de endotheelcellen van pial arteriële segmenten met behulp van fluorescerende kleuren, gecombineerd met confocale laser scanning microscopie 4. Verder wordt ER-α in de kernen en in het cytoplasma van de rat basilaire slagaders 5. De receptoren zijn overvloedig en fluoresceren helder, maar heldere visualisatie van discrete groepen receptoren moeilijk is waarschijnlijk te wijten aan de cijfers in vele cellagen van pial schip segmenten. Bovendien zijn veel rapporten met behulp van immunohistochemische technieken gecombineerd met confocale microscopie slecht detail aan de eisen van cruciaal belang voor de voortplanting van experimenten 6. Ons doel voor dit artikel is om een eenvoudige techniek te beschrijven t te optimaliserenHij vlekken en visualisatie van ER-α met behulp van cross-sectionele plakjes pial arteriolen te verkrijgen van vrouwelijke rat hersenen. We hebben eerst perfuseren ratten met Evans blauwe kleurstof om gemakkelijk te bepalen oppervlak pial slagaders die we isoleren onder een dissectie microscoop. Het gebruik van een cryostaat tot 8 micrometer doorsnede van de slagaders slice laat ons toe om dunne vat secties te verkrijgen zodat de verschillende schepen vliegtuigen meer duidelijk gevisualiseerd. Dwars door het schip in plaats van het gebruik van een klein vaartuig segment heeft het voordeel van een betere weergave van de endotheel-en gladde spieren lagen. Daarnaast is het gebruik van een digitale microscoop immunofluorescentie met uitgebreide diepte-software produceert heldere beelden van tien tot twaalf verschillende schepen vliegtuigen en is minder kostbaar dan het gebruik van een confocale laser scanning microscoop.
Eerder toonden we aan dat na de tijdelijke globale ischemische hersenschade de pial slagader vermogen om met een diameter veranderen als reactie op beide vaatverwijders 7, 8 en 9 vasoconstrictoren duidelijk is depressief bij jonge ratten ovariëctomie. Chronische oestrogeen repletie herstelt vasomotorische reacties 7-9. Verder vertraagde oestrogeen vervangende keert de gunstige effecten van oestrogeen op de pial slagader vaatverwijdende capaciteit van 10 die ons de vraag of op lange termijn oestrogeen uitputting ER-α dichtheid van invloed op in de cerebrovasculature. We waren van plan om immunofluorescentie etikettering gecombineerd met western blotting op veranderingen in de ER-α uitdrukking uit te werken in reactie op chronische uitputting oestrogeen gebruik. Want we hadden enige moeite visualisatie van discrete groepen van receptoren we wijzigde de methode die we zien hier. Daarom is onze primaire doel in deze studie was om eerst de ontwikkeling van een relatief eenvoudige methode om de visuele optimaliserenisering van de receptoren in pial arteriolen. In overleg met verschillende rapporten 6,11,12 vonden we het noodzakelijk om aanpassingen voor het type weefsel waren we sonderen, het monster dikte, de verdeling van de ER-α in het vat, evenals de mate van niet-specifieke binding te maken .
Onze methode is zeer effectief om de aanwezigheid van de ER-α in pial vat plakjes te visualiseren. Maar zoals anderen al eerder gewezen op het succesvol gebruik van deze methoden is sterk afhankelijk van de specificiteit en de concentraties van de antilichamen, de subcellulaire locatie van de eiwitten van belang, fixatie en het blokkeren van protocollen en weefsel handling 12. Voorafgaand aan de visualisatie van ons schip de voorbereidingen brachten we de tijd uit te werken al deze variabelen. We hebben aangetoond hoe wij nodig om sommige van onze aanpak aan te passen in deze krant.
We stellen om optimaal ER-α visualiseren pial arteriolen en dit zijn enkele nieuwe uitdagingen.Ten eerste is de gemiddelde grootte van een rat pial slagader ligt tussen de 35 tot 50 micrometer maken van isolatie en verwijdering uit de hersenen oppervlak enigszins lastig. Wij vonden dat perfusie met Evans blauwe kleurstof voor offer maakt dissectie van de slagaders makkelijker. Evan's blue kan invloed hebben op fluorescentie, maar voelen we dat het voordeel van het gebruik van deze kleurstof zijn kleinere nadelen opwegen tegen. In ons protocol de schepen zijn verschillende malen gewassen. Dit minimaliseert de resterende kleurstof in de vaten en vermindert de mogelijke gevolgen van de kleurstof op fluorescentie. Een andere moeilijkheid die we tegenkwamen was dat de dikte van de pial vaatsegmenten duidelijke visualisatie van de receptoren bemoeilijkt. Daarnaast konden we niet krijgen in het bijzonder heldere beelden waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de ER-α was verspreid over verschillende cellagen. We probeerden het werken met longitudinale schip plakken (zoals anderen al hebben), maar vanwege de kleine omvang pial was het moeilijk om de schepen handvat en het verdraaien van de schepen te voorkomen dat tijdens het monterenop dia's zelfs met behulp van een microscoop. Tot slot hebben we met succes gewijzigd onze techniek met behulp van een cryostaat en snijden van het schip dwars in om 8 urn dik ringen. De ringen zijn makkelijker te hanteren en meerdere kan worden gemonteerd op een dia.
Zodra we verwierf de schepen vonden we het noodzakelijk om de effectiviteit van de eerste flits bevriezen van de weefsel dan de vaststelling van de schepen zoals voorgesteld door Danseshatalb en geassocieerde deelnemingen 11 te testen. Hoewel we vonden iets minder achtergrond immunofluorescentie, hebben we ook opgemerkt dat de receptoren in lood minder intens te maken visualisatie van de receptoren moeilijker. Dus geven we de voorkeur om eerst de gehele hersenen te bevriezen en op te slaan tot het nodig is (over het algemeen tussen de 1-2 maanden). Vervolgens hebben we trekken uit de schepen zoals beschreven en voorafgaand vast de schepen te snijden met de cryostaat. zoals we zien hier.
Een noodzakelijke stap is om de controles uitgevoerd met zowel de primaire als het secundaire antilichaam afzonderlijkspecificiteit en achtergrond immunofluorescentie te bepalen. Oestrogeen receptor-α antilichamen kan het moeilijk zijn om mee te werken. In feite hebben we geprobeerd drie verschillende primaire antilichamen (1 monoklonale en polyklonale 2) voordat we waren tevreden met het succes van onze receptor vlekken. Als onderdeel van onze controles hebben we eerst geverifieerd de specificiteit van het primaire antilichaam door weglating van de toevoeging van het primaire antilichaam. Figuur 2D toont het vat zonder primaire antilichaam. Er is geen vlekken en een klein beetje achtergrond signaal. Omdat het primaire antilichaam is polyklonaal, is er wat diffuse niet-specifieke achtergrond kleuring. Ten tweede, voegden we het primaire antilichaam, maar niet het secundaire antilichaam (fig. 2E). Men kan een mooie marge die de autofluoresence langs de endotheliale grenzen van de schepen. Dit is consistent met het werk van Dan en medewerkers 5. Echter, noch de kleine punten van immunofluorescentie dat ER-α vertegenwoordigen, noch de korrelige uitstraling reflecting de aanwezigheid van een groot aantal receptoren kan worden opgespoord zonder dat de combinatie van zowel de primaire en secundaire antilichamen. We merkten een duidelijk patroon van autofluoresence langs de endotheliale marges van de schepen. Deze onafhankelijke tests voor antilichamen specificiteit zijn belangrijk omdat ze bevestigen dat de specificiteit van het antilichaam voor ER-α en de secundaire antilichaam bindt aan de primaire.
Tot slot, zoals wordt aangetoond door anderen vier, vijf de hersenen de bloedvaten bevatten tal van ER-α sub-type receptoren. In onze handen, het voorbereiden van 8μm dwarsdoorsnede segmenten van geïsoleerde pial slagaders verhoogt de kleuring en visualisatie van de receptoren. Traditionele methoden gebruiken confocale microscopie om de monsters te onderzoeken. Het hebben van de capaciteit om seriële optische secties uitzicht vanaf dikke exemplaren is een belangrijk voordeel van confocale microscopie. Toch kan de aankoop van een goede confocale microscoop zijn erg duur. Door het gebruik van Extended Diepte (EDF) software, vonden we datkunnen verminderen, onze apparatuur kosten. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop met EDF wij van heldere beelden en zijn in staat om pial arteriële ER-α zichtbaar op verschillende niveaus met behulp van Z-stacks. Een belangrijk voordeel van het EOF software is dat het beeld vast te leggen maakt op een manier om effectief creëren van een 3-D beeld van de beelden. Voor laboratoria die geen toegang hebben tot een confocale microscoop of de fondsen te kopen een een digitale fluorescentiemicroscoop met toegeëigend software kan een praktische en minder kostbare optie, afhankelijk van de doelstellingen van de onderzoeker te worden.
The authors have nothing to disclose.
Het werk voor dit project werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health R01-NR5339 en de geüniformeerde diensten Universiteit van de Health Sciences-R061LD.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
EVANS BLUE | Sigma | E-2129 |
PBS 10X | Sigma | P-5493 |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 |
Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 |
Triton X-100 | Sigma | T9284 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 |
ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz | H-184 |
Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 |
Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI |
Vector Lab | H-1200 |