Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren zu demonstrieren Immunfluoreszenz Detektion von Östrogen-Rezeptor-α (ERa) in Ratten Pia arteriellen Scheiben mit einem digitalen Immunfluoreszenz-Mikroskop zu optimieren.
Viele von Östrogen-Effekten auf vaskuläre Reaktivität sind durch die Interaktion mit Östrogen-Rezeptoren 1, 2, 3 vermittelt. Obwohl zwei Untertypen (Östrogen-Rezeptor-α und β) bestehen, hat Östrogen-Rezeptor-α sowohl in den glatten Muskelzellen und Endothelzellen in der Pia-arterielle Segmente unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie 4 kombiniert identifiziert worden. Darüber hinaus ist ER-α in den Kernen und im Zytoplasma der Ratte basilaris Arterien 5 befindet. Die Rezeptoren sind reichlich vorhanden und fluoreszieren hell, aber klare Darstellung der diskreten Gruppen von Rezeptoren ist schwierig wahrscheinlich auf die Zahlen in vielen Zellschichten Pia Gefäßsegmente entfernt. Darüber hinaus haben viele Berichte mit immunhistochemischen Techniken mit der konfokalen Mikroskopie schlecht detailliert die Anforderungen von entscheidender Bedeutung für Reproduktion Versuche 6 gekoppelt. Unser Ziel für diesen Artikel ist eine einfache Technik zu beschreiben, t zu optimierenHE-Färbung und Visualisierung von ER-α mit Querschnitts-Scheiben pialen Arteriolen erhalten von weiblichen Gehirn von Ratten. Zunächst perfuse Ratten mit Evans blauen Farbstoff leicht identifizieren Oberfläche pialen Arterien, die wir isolieren unter einem Binokular. Die Verwendung eines Kryostaten bis 8 um Querschnitte der Arterien Scheibe ermöglicht es uns, dünne Gefäßabschnitte zu erhalten, so dass unterschiedliche Behälter Flugzeuge mehr übersichtlich visualisiert werden. Quer durch das Schiff, anstatt mit Hilfe eines kleinen Schiffes Segment hat den Vorteil einer einfacheren Betrachtung der Endothel-und glatten Muskelschichten. Darüber hinaus eines digitalen Immunfluoreszenz-Mikroskop mit erweiterter Tiefenschärfe Software erzeugt scharfe Bilder von zehn Minuten vor zwölf verschiedene Schiffstypen Flugzeuge und ist kostengünstiger als die Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop nutzen.
Bisher haben wir gezeigt, dass nach transienter globaler Ischämie-Hirn-Trauma der pialen Arterie Fähigkeit, Durchmesser als Reaktion auf beide Vasodilatatoren 7, 8 und 9 zu ändern Vasokonstriktoren deutlich ist in jungen ovariektomierten Ratten deprimiert. Chronische Östrogen Fülle wieder vasomotorische Reaktionen 7-9. Darüber hinaus kehrt verzögert Östrogen-Ersatztherapie die wohltuende Wirkung von Östrogen auf die Pia Arterie vasodilatatorische Kapazität 10 führt uns zur Frage, ob langfristige Östrogen Erschöpfung ER-α Dichte wirkt in der cerebrovasculature. Wir planten, Immunofluoreszenz Markierung mit Western-Blot auf Veränderungen in ER-α Expression als Reaktion auf chronische Erschöpfung Östrogen bewerten kombinierten Einsatz. Da wir einige Schwierigkeiten bei der Visualisierung von diskreten Gruppen von Rezeptoren hatten wir modifiziert die Methode, die wir zeigen hier. Deshalb war unser primäres Ziel in dieser Studie zum ersten Entwicklung eine relativ einfache Methode, um die visuelle Optimierungsierung der Rezeptoren in pialen Arteriolen. In Absprache mit mehreren Berichten 6,11,12 fanden wir es notwendig, Anpassungen für die Art des Gewebes waren wir Sondieren, die Dicke der Probe, die Verteilung von ER-α in das Schiff, als auch der Grad der unspezifischen Bindung zu .
Unsere Methode ist sehr effektiv, um das Vorhandensein von ER-α in Pia Schiff Scheiben sichtbar zu machen. Aber wie andere zuvor den erfolgreichen Einsatz dieser Methoden hingewiesen ist stark abhängig von der Spezifität und Konzentration der Antikörper, die subzelluläre Lokalisation der Proteine von Interesse, die Fixierung und blockiert Protokolle und Gewebe Handling 12. Vor Visualisierung unseres Schiffes Vorbereitungen verbrachten wir Zeit zu arbeiten, alle diese Variablen. Wir haben deutlich gemacht, wie wir einige unserer Herangehensweise in diesem Papier einstellen benötigt.
Wir wollten optimal visualisieren ER-α in pialen Arteriolen und diese vor einigen Herausforderungen.Erstens ist die durchschnittliche Größe einer Ratte pialen Arterie zwischen 35-50 um was Trennung und Entfernung aus der Hirnoberfläche etwas tricky. Wir fanden, dass Perfusion mit Evans blauen Farbstoff vor der Tötung macht Dissektion der Arterien erleichtern. Evans-Blau kann sich auf Fluoreszenz, aber wir spüren, dass der Vorteil der Verwendung dieser Farbstoff seiner geringen Nachteile überwiegen. In unserem Protokoll die Gefäße werden mehrmals gewaschen. Dies minimiert die verbleibende Farbstoff in die Gefäße und reduziert die möglichen Auswirkungen des Farbstoffes auf Fluoreszenz. Eine weitere Schwierigkeit, die wir hatten, war, dass die Dicke der Pia Gefäßsegmente klare Darstellung der Rezeptoren erschwert. Darüber hinaus konnten wir nicht erhalten, besonders klare Bilder wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass ER-α durch mehrere Zellschichten wurde verstreut. Wir haben versucht, die Arbeit mit Längs-Schiff Scheiben (wie andere), aber aufgrund der kleinen Pia Größe war es schwierig, die Gefäße behandeln und zu verhindern Verdrehen der Schiffe während der Montageauf Folien auch unter dem Mikroskop. Schließlich haben wir erfolgreich unsere Technik mit Hilfe eines Kryostaten und Schneiden des Schiffes quer in bis 8 um dicke Ringe geändert. Die Ringe sind leichter zu handhaben und einige können auf einem Schlitten montiert werden.
Einmal haben wir das Schiffe hielten wir es für notwendig, um die Wirksamkeit der erste Blitz Einfrieren des Gewebes dann Fixierung der Gefäße durch Danseshatalb und Mitarbeiter 11 vorgeschlagen zu prüfen. Obwohl wir etwas weniger Hintergrund Immunfluoreszenz finden wir auch festgestellt, dass die Rezeptoren weniger stark machen Visualisierung der Rezeptoren schwieriger gefärbt. Daher bevorzugen wir die ersten, die gesamte Gehirn einfrieren und lagern, bis sie benötigt (in der Regel zwischen 1-2 Monaten). Wir ziehen aus den Gefäßen, wie beschrieben und fixieren die Gefäße vor dem Schneiden mit dem Kryostaten. wie wir demonstrieren hier.
Ein notwendiger Schritt ist, die Kontrollen sowohl mit dem primären und dem sekundären Antikörper separat ausgeführtzur Spezifität und Hintergrund Immunfluoreszenz zu bestimmen. Estrogen-Rezeptor-α-Antikörpern kann schwierig sein, mit zu arbeiten. In der Tat haben wir versucht, 3 verschiedene Primärantikörper (1 monoklonalen und 2 polyklonal), bevor wir mit dem Erfolg unserer Rezeptor Färbung zufrieden waren. Als Teil unserer Kontrolle übernehmen wir zunächst die Spezifität des primären Antikörpers durch Unterlassung der Addition des primären Antikörpers nachgewiesen. 2D zeigt das Schiff ohne Primärantikörper. Es gibt keine Flecken und nur ein wenig Hintergrund-Signal. Da der primäre Antikörper polyklonal, gibt es einige diffuse unspezifische Hintergrundfärbung. Zweitens, haben wir den primären Antikörper, nicht aber der sekundäre Antikörper (Abb. 2E). Man sieht eine schöne Marge, die die Autofluoreszenz entlang der endothelialen Grenzen der Gefäße. Dies steht im Einklang mit der Arbeit von Dan und Kollegen 5. Doch weder die kleinen Punkte Immunfluoreszenz, dass ER-α stellen, noch die körniges Aussehen reflecting die Anwesenheit von zahlreichen Rezeptoren kann ohne die Kombination der beiden primären und sekundären Antikörper nachgewiesen werden. Wir haben festgestellt, ein deutliches Muster der Autofluoreszenz entlang der endothelialen Rande der Gefäße. Diese unabhängigen Tests für Antikörper-Spezifität sind wichtig, da sie die Spezifität der Antikörper für die ER-α zu bestätigen und der sekundäre Antikörper bindet an den primären.
Zum Schluss, wie andere 4 gezeigt, enthalten 5 Gehirn Blutgefäße zahlreichen ER-α-Subtyp-Rezeptoren. In unseren Händen, die Vorbereitung 8μm Querschnitt Scheiben von isolierten pialen Arterien verbessert Färbung und Visualisierung der Rezeptoren. Traditionelle Methoden der konfokalen Mikroskopie, um die Proben zu untersuchen. Die Fähigkeit, serielle optische Schnitte von dicken Proben Sicht ist ein wichtiger Vorteil der konfokalen Mikroskopie. Allerdings können Kauf einer Ware konfokalen Mikroskop sehr teuer sein. Durch die Verwendung erweiterter Tiefenschärfe (EDF)-Software, fanden wir, dasskonnten unsere Geräte zu senken. Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops mit EDF erhielten wir klare Bilder und sind in der Lage, Pia arteriellen ER-α auf mehreren Ebenen mit Z-Stapel zu visualisieren. Ein wesentlicher Vorteil der EDF-Software ist, dass es Bilderfassung ermöglicht in einer Art und Weise um effektiv eine 3-D Bild von den Bildern. Für Laboratorien, die keinen Zugang zu einem konfokalen Mikroskop oder die Mittel zum Kauf einer digitalen Fluoreszenzmikroskop mit angeeignet Software kann eine praktische und weniger kostspielige Option, je nach den Zielen der Ermittler werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit für dieses Projekt wurde durch Mittel der National Institutes of Health R01-NR5339 und den uniformierten Diensten University of the Health Sciences-R061LD unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
EVANS BLUE | Sigma | E-2129 |
PBS 10X | Sigma | P-5493 |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 |
Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 |
Triton X-100 | Sigma | T9284 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 |
ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz | H-184 |
Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 |
Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI |
Vector Lab | H-1200 |