Summary

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Published: September 09, 2011
doi:

Summary

Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L'espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.

Abstract

Γδ cellule T in grado di riconoscere e rispondere a una vasta gamma di antigeni indotta da stress, sviluppando in tal modo innato attività ampio anti-tumorale e anti-infettivi. 1 La maggior parte dei γδ cellule T nel sangue periferico hanno il recettore delle cellule T Vγ9Vδ2. Queste cellule riconoscono l'antigene in un complesso maggiore di istocompatibilità modalità indipendente e sviluppare una forte funzioni citolitica e Th1-come effettore. 1 Perciò, γδ cellule T sono cellule effettrici candidato attraente per l'immunoterapia del cancro. Vγ9Vδ2 cellule T rispondere a phosphoantigens come (E)-4-idrossi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), che è sintetizzata nei batteri attraverso isoprenoidi biosintesi, 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), che viene prodotto nelle cellule eucariotiche attraverso la via mevalonato. 3 In condizioni fisiologiche, la generazione di IPP ​​nella cella nontransformed non è sufficiente per l'attivazione delle cellule T γδ. Disregolazione della via mevalonato nelle cellule tumorali porta all'accumulo di IPP ​​e l'attivazione delle cellule T γδ. 3 Poiché aminobifosfonati (come pamidronato o zoledronato) inibiscono la farnesil pirofosfato sintasi (FPP), l'enzima agisce a valle di IPP ​​nella via mevalonato, i livelli intracellulari di IPP e sensitibity γδ per il riconoscimento delle cellule T possono essere terapeuticamente aumentato di aminobifosfonati. IPP accumulo è meno efficiente in cellule nontransfomred rispetto alle cellule tumorali con una concentrazione farmacologicamente rilevanti aminobifosfonati, che ci permettono l'immunoterapia per il cancro attivando γδ cellule T con aminobifosfonati 4. Interessante, IPP si accumula nei monociti quando PBMC sono trattati con aminobifosfonati, a causa di efficienti assunzione di droghe da queste cellule 5. monociti che si accumulano IPP diventare cellule presentanti l'antigene e stimolare Vγ9Vδ2 cellule T nel sangue periferico. 6 Sulla base di questi meccanismi, abbiamo sviluppato una tecnica per la grande espansione del γδ colture di cellule T con zoledronato e interleuchina -2 (IL-2). 7 Altri metodi per l'espansione delle cellule T γδ utilizzare il sintetico pirofosfato bromohydrin phosphoantigens (BrHPP) 8 o 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) 9. Tutti questi metodi consentono ex vivo di espansione, con conseguente gran numero di γδ cellule T per l'uso in immunoterapia adottiva. Tuttavia, solo zoledronato è un reagente approvato dalla FDA disponibili in commercio. Zoledronato espanso γδ cellule T CD27 schermo CD45RA fenotipo effettore memoria e la loro funzione può essere valutata da IFN-γ test di produzione 7.

Protocol

1. Isolamento dei PBMC Prelievo di sangue (7,5-8,0 ml) in una provetta BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio. Il tubo contiene un anticoagulante eparina sodica e di un Ficoll-Hypaque densità del fluido, più una barriera di gel di poliestere, che separa i due liquidi. Centrifuga tubo / campione di sangue a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) in un rotore orizzontale (swing-out testa) per 20 minuti a 1800 x g. Interruttore centrifuga freni sbloccati. Dopo la centrif…

Discussion

Il metodo presentato qui permette l'espansione delle cellule T efficiente γδ da PBMC. γδ cellule T attivate e ampliato da zoledronato e IL-2 sviluppano completa funzioni effettrici, riflessa dalla produzione di citochine e citotossicità. E 'stato riportato che il sintetico phosphoantigens pirofosfato bromohydrin (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) anche espandere le cellule T γδ, tuttavia, non sono disponibili in commercio. Al contrario, zoledronato è già concesso in licenza per le appli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Reagent name Company Catalogue number Comments (optional)
ZOMETA Novartis Pharma K. K   zoledronate
PROLEUKIN Novartis Pharmaceuticals   human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD 362753  
RPMI1640 Invitrogen 21870-076  
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7  
OpTmizer Invitrogen 0080022SA  
brefeldin A Sigma B5936-200UL  
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1MG  
ionomycin Sigma 13909-1ML  
IntraPrep BECKMAN COULTER A07803  
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07746 FITC
A07749 PE/Cy5
 
anti-human CD4-ECD BECKMAN COULTER 6604727  
anti-human CD8-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607011  
anti-human CD14-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07765  
anti-human CD19-PE BECKMAN COULTER A07769  
anti-human CD45-ECD BECKMAN COULTER A07784  
anti-human CD56-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07789  
anti-human TCRαβ-PE BECKMAN COULTER A39499  
anti-human TCR Vγ9-FITC BECKMAN COULTER IM1463  
anti-human CD27-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607107  
anti-human CD45RA-ECD BECKMAN COULTER IM2711  
anti-human CD69-PE BD 555531  
anti-human NKG2D-PE BECKMAN COULTER A08934  
Anti-humal IFNγ-PE BECKMAN COULTER IM2717U  
Mouse IgG1 isotype control-PE BECKMAN COULTER A07796  
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07797 A07798  

References

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Cite This Article
Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., Kakimi, K. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

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