Immunohistochimie: coupes en paraffine utilisant le kit de Vectastain ABC Vector Labs

Coloration des coupes à la paraffine Déparaffinage diapositives avec du xylène (Fisher X3 S -4) 3x pendant 5 minutes chacun (xylène changent chaque mois selon l'utilisation, le xylène est toxique). Utilisez de la vaisselle et les couvertures pour 20 diapositives de Fisher ref 08-812-1A et étagères faites pour s'adapter à ces plats. 200 ml de liquide par plat. Hydrater par gradient de l'alcool comme suit (changement de gradient toutes les 2 semaines): 2x dans l'éthanol 100% (Fisher # A406-20) pendant 2 min de chaque 2x dans l'éthanol 95% pendant 2 min de chaque 1x dans l'éthanol 70% pendant 2 min 1x dans l'éthanol 50% pendant 2 min 1x dans l'éthanol 30% pendant 2 min 1x ddH 2 O pendant 2 min Faire tremper dans du DPBS pendant 5 min (DPBS = phosphate de Dulbecco modifié saline tamponnée avec du Ca 2 + et Mg 2 +). La récupération Antigène: Préchauffer le tampon Na-citrate (10 mM, pH 6,5) dans le micro-ondes. Cuire les diapositives pendant 15 min au micro-ondes. Les diapositives doivent jamais à sec afin de vérifier toutes les minutes et ajouter Na-citrate, si nécessaire. Laissez refroidir à température ambiante. Bloquer l'activité peroxydase endogène avec 1% de H 2 O 2 dans DPBS pendant 20 min (1,5 ml de bouillon de 30% Sigma H-1009 dans DPBS 50 ml). Faire tremper dans du DPBS 3 x 5 min. Bloc des sites non spécifiques par incubation une nuit à +4 ° C dans du DPBS + 5% de sérum albumine bovine (BSA) + 0,1% de Na azide + 5% de sérum. Remarque: Le choix de sérum dépendra de l'espèce dans laquelle des anticorps utilisés pour la coloration ont été faites. Bloc avec le sérum de l'espèce dans laquelle le secondaire Ab (conjugué à la biotine) a été faite. Si ce n'est pas disponible, l'utilisation de sérum provenant d'une espèce différente de celle dans laquelle l'Ac primaire a été rendu. Bloquer les sites de la biotine avec le kit avidine / biotine blocage (Vector Laboratories catalogue # SP-2001): Incuber avec l'avidine D pendant 15 min. Rincer brièvement avec DPBS. Incuber avec la solution de biotine pendant 15 min. Incuber dans l'enseignement primaire Ab pendant 2 heures à température ambiante, dans DPBS + 2% de BSA + 0,1% + NaAzide 2% de sérum (le même que pour le blocage étape). Faire tremper dans du PBS 3 x 5 min. Incuber avec l'Ab secondaire conjugué à la biotine pendant 1 heure à température ambiante dans DPBS + 2% de BSA + 0,1% Na azide + 2% de sérum (le même que celui utilisé pour l'étape de blocage). Préparer le réactif ABC dans le même temps, car elle doit se développer pendant au moins 30 min avant de les utiliser! (Voir Matériaux) Préparer dans un tube conique de 50 ml. En DPBS 15 ml (pas de sérum, aucun azoture) ajoutez 3 gouttes de réactif A, mélangez et ajoutez 3 gouttes de réactif B et mélanger. Ne pas tordre les bouteilles, au lieu d'attendre pour les gouttes pour former par leurs propres moyens. ABC kit PK-6100 Vectastain de Vector Labs. Faire tremper dans du DPBS 3 x 5 min. Incuber avec le réactif ABC pendant 30-45 min à température ambiante. Faire tremper dans du DPBS 3 x 5 min. Préparer substrat de la peroxydase DAB (Vector Labs # SK-4100) dans 5 ml ddH O 2 dans un flacon en verre juste avant son utilisation (voir Matériaux) 2 gouttes de solution de stock tampon, mélanger 4 gouttes de DAB, mélanger (devrait devenir légèrement brun) 2 gouttes de H 2 O 2, mélanger Déposer le substrat DAB au sommet de la glisse et de regarder pour la coloration brune. Trempez glisse dans la glace + eau du robinet pour arrêter la réaction. Rincer sous l'eau froide du robinet pendant 5 min. Contre à l'hématoxyline (20 sec; Fisher CS401-D) et rincer à l'eau du robinet jusqu'à l'eau sort claire. Déshydrater dans l'alcool à partir de gradient éthanol à 30% jusqu'à 100% d'éthanol (2 minutes chacun). Faire tremper dans du xylène 3 x 5 min. Monter avec Permount (Fisher # SP15-100): mettre un peu au-dessus de la section sur la diapositive et appuyez lentement sur la section d'une lamelle, sans bulles d'air. Ne pas déplacer la lamelle jusqu'à séchage complet, qui prend environ 24 heures.