1. Craniectomy אתר כירורגי סטרילי מוכן כולל מכשיר יישור stereotaxic (מכשירים Kopf) לעכברים עם בעל גז העכבר בראש הרדמה (Kopf מכשירים) מחובר למכונת הרדמה עם O 2 סומק (פארק המדע) על מנת לאפשר שאיפה מתמשכת של isoflurane במהלך הניתוח . כרית חימום שמרו על 37 מעלות צלזיוס ממוקם תחת העכבר במהלך הניתוח. מיקרוסקופ כירורגי מקור האור הוא זקוק. הנסיין צריך ללבוש חלוק מעבדה, מסכת מנתחים, כיסוי רגליים, כפפות, כיסוי ראש. כל הכלים והחומרים קשר באתר כירורגית צריך להיות מעוקר. רכזת פציעה, המורכב סוף הנשי של Luer-Lok, נוצר על ידי חיתוך קצה המתכת של 20 גרם ½ 1 "מחט (בקטון דיקינסון) בסכין גילוח. לרכזת יש לחתוך עם הטיה קלה יש פתח בקוטר של כ 3 מ"מ פנימית. המקדחה (ראה שלב 1.10) ניתן להשתמש כדי למדוד לפברק רכזת פגיעה בקוטר הנכון. רכזת אחת נדרש לכל בעלי החיים. רכזת יצורף הגולגולת ומחובר LFP המכשיר, כדי לספק את הדופק של לחץ. חוט ניילון מוצק (בקוטר 1.7 מ"מ, למשל קו גוזם עשב) הוא חתך לתוך ~ 1 מ"מ עובי הדיסקים באמצעות סכין גילוח. שוב, דיסק אחד נדרש לכל בעלי החיים. זה משמש כדי לייצב את המקדחה בזמן ביצוע craniectomy (ראה שלב 1.10). עכברים יכולים להיות זן ולכל גיל (אנו משתמשים בעיקר C57BL / 6 הגילאים 1-9 חודשים). העכבר הוא שקלו הרדים בתא קטן אינדוקציה (טרום מלאים 4-5% isoflurane ב 100% O 2) במשך דקה לפחות 1. עבור כאבים מקדימה, הזרקה של buprenorphrine (0.1 מ"ג / ק"ג) ניתנת intraperitoneally והעכבר ממוקם בחזרה לתוך החדר עוד דקה. משטר משככי כאבים צריכה להיות מאושרת על ידי התייעצות עם השימוש בבעלי חיים הוועדה המקומית אכפת. השיער בחלק העליון של ראשו של עכבר חיתוך קרוב לעור ככל האפשר. העכבר הוא ממוקם מכשיר יישור stereotaxic מצויד לנשוך מצופה שנועדה לנהל הרדמה גז נדיף (Kopf מכשירים). רמת הגז isoflurane מצטמצם 2% או השפעה. קצב הנשימה היא פיקוח חזותית במהלך הניתוח. פרמטרים פיזיולוגיים נוספים כגון גזים בדם (p O 2, p CO 2), ה-pH בדם או לחץ דם ניתן למדוד באמצעות ציוד מתאים במהלך ההליך. עין דמעות מלאכותיות משחה סיכה הוא לשים על העיניים של העכבר באמצעות מטוש צמר גפן כדי לשמור עליהם מפני התייבשות. Povidone יוד מוחל על העור בין העיניים והצוואר עם המוליך כותנה ואחריו אלכוהול 70%. היישום של יוד povidone ואלכוהול חוזרים עבור סכום כולל של 3 פעמים. חתך בקרקפת קו האמצע הוא עשוי העיניים על הצוואר באמצעות אזמל (# 15 להב) והעור חזר עם מהדק בולדוג קטן (כלים המדע פיין # 18050-28) כדי לחשוף את הגולגולת ומספקים שדה כירורגי ברור. מהדק בולדוג לתלות את הקצוות לרוחב הגולגולת. הרדמה מקומי bupivacaine (0.025% בשנת מלוחים) על הגולגולת עם המוליך כותנה ו fascia שרוטה מהגולגולת עם קצה הכלי שיניים או מגרד העצם (למשל, כלי מדעי בסדר, # 10075-16). סמן קבע משמש כדי לסמן את הגולגולת באמצע הדרך בין גבחת ו למבדה בין תפר sagittal ו לרוחב הרכס מעל באונה הימנית (~ 2 מ"מ ימינה של קו האמצע). ירידה של דבק cyanoacrylate Loctite (Loctite טאק פאק 454) הוא לשים פלסטיק לשקול סירה לצד מלקחיים אחיזה (כלים המדע פיין, דומון # 6) משמשים כדי לטבול דיסק של חוט ניילון עשב מוצק (ראה 1.3 לעיל) לתוך הדבק ולאחר מכן לחץ על הדיסק על סימן בגולגולת. אחת עד שתי טיפות של מאיץ Loctite מועבר על גבי הדיסק בעזרת מזרק 1ml ו -26 08/03 מחט G לגרום התקשות הדבק. בדיקת עמידה של הדיסק לגולגולת לפני שתמשיך. מניחים 3 החיצונית מ"מ קוטר המקדחה (חנות מחקר מכשור, אוניברסיטת פנסילבניה) על הדיסק ספין בכיוון השעון עד שיש לך לחתוך דרך הגולגולת. בדוק את התקדמותו של המקדחה לעתים קרובות, כדי למנוע קידוח רחוק מדי לתוך הגולגולת פריצת הדורה. יהיה דילול של הגולגולת מסביב להיקף הדיסק ואת דש הגולגולת ירגיש משוחרר כשלוחצים עליו קלות. מניחים את הכלי שיניים מקביל / אופקית על פני השטח של הגולגולת לחטט תחת הגולגולת להרים את הכיסוי עד העצם. לנתק את עצם הגולגולת עם מלקחיים. אם יש כמות קטנה של דימום, ללא פשרות של דורה, להשתמש המוליך כותנה להפעיל לחץ עד שהדימום ייפסק ולמנוע אבק עצם להגיע אל דורא. עם זאת, אם יש הפרה של הדורה כזה בקיעה כי הוא גלוי, החיה יש לסלק מן הניסוי על ידי המתת חסד הומנית. צעד זה דורש תרגול מספיקכדי להשיג את מיומנות כירורגית הנדרש. בעזרת מלקחיים, לשמור על הרכזת פגיעה בעמדה מעל craniectomy בגולגולת, כך ההטיה של הרכזת מיושר עם העקמומיות של הגולגולת (כלומר את הקצה יותר של הרכזת נמצאת ליד הרכס לרוחב הגולגולת). בינתיים, באמצעות מקל עץ, חתוך בזווית בסכין גילוח יש קצה חד, להחיל ג'ל דבק סופר סביב בקצוות החיצוניים של הרכזת עם היד הנגדית ולייצב את הרכזת עד שהיא מודבקת זקוף מעל החור. יש להקפיד לא להגיע דבק על גבי הדורה. דבק על הדורה יגרום הנחתה של הפציעה. בעזרת כוס נייר קטנה, לערבב methyl-methacrylate אקריליק שיניים (Liquid Jet אקריליק עם שרף פרם reline / תיקון, שיין באטלר) כדי ליצור פתרון צמיגה. השתמש מזרק 1 סמ"ק עם מחט לא מחובר להחיל בטון מסביב הרכזת פציעה. המלט צריך לכסות את תחתית מ"מ 2 של הרכזת פציעה, כמו גם את הגולגולת חשוף שמסביב. התפרים הגולגולת חתומות עם מלט כדי להבטיח כי בולוס נוזלים מפציעה נשאר בתוך חלל הגולגולת. מלאו את הרכזת עם NaCl 0.9% סטרילי (סליין) באמצעות מזרק מחט קהה. מלוחים ישמור על לחות הדורה במהלך שלב ההחלמה. בנוסף, אם הרכזת פציעה לא נשאר מלא, כי יציין דליפה חיבור הרכזת אל הגולגולת רכזת חדשה צריכה להיות מחוברת. העכבר יש לתת זריקה 0.25 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית IP, הסירו מהמכשיר יישור stereotaxic והושמו בכלוב ריק עם מכסה ללא חוט בר בצלחת ההתחממות. מניחים כמה hydragel בתחתית הכלוב ולאפשר העכברים להתאושש עבור 1-2 שעות. 2. אינדוקציה של פציעה הפעל את האוסילוסקופ (Tektronix TDS 1001B, ערוץ אוסצילוסקופ Digi אחסון 40 MHz, 500Ms.s) ו מגבר (Inducer טראומה לחץ מגבר מתמר) המחובר למכשיר LFP. ודא כי המכשיר LFP (עיצוב ייצור מותאמים אישית, Virginia Commonwealth University) לבין צינורות בלחץ גבוה (אורך 41cm, נפח 2ml, בקסטר # 2C5643) המחוברים אליה מלאים מים סטריליים ללא בועות אוויר. בסוף הצינור הוא פיסת זכר Luer-Lok. עם סיום Luer-Lok של צינורות סגורה, ולספק פולסים בדיקה על ידי שחרור המטוטלת. המכשיר צריך להיות דרוך על ידי מתן כ 10 פולסים הבדיקה. אשר מטוטלת שנותנת אות חלקה על אוסצילוסקופ ואת המגבר. אות רועש מעיד אוויר במערכת כי יש להסיר לפני מתן הדופק פציעה. משך הדופק צריך להיות בערך 20 msec. המגבר מתמר מסופק עם המכשיר LFP הוא מכויל כך 10 mV = 1.0 פאונד לאינץ' מרובע (PSI). אחת האווירה (ATM) = 14.7 PSI. הלחצים פגיעה נמסר בדרך כלל בטווח של 0.9-2.1 אטמוספרות לייצר מגוון רחב של ליישר פעמים רפלקס ואת התמותה הגוברים הקשורים בצקת ריאות. פציעה קלה נחשב זמן ליישר רפלקס מ 2 – 4 דקות ו 0 – שיעור התמותה של 5%. פגיעה מתונה נחשבת רפלקס ליישר זמן של 6 – 10 דקות ו 10 – שיעור התמותה 20%. במידת הצורך, להתאים את הזווית של המטוטלת כדי להגדיל או להקטין את עוצמת הדופק. הזווית של נקודת ההתחלה של המטוטלת הוא כ 10 מעלות. לאחר התאמת המכשיר LFP, הקפידו לפתוח את סוף Luer-Lok של צינורות. העכבר ממוקם תא הרדמה 4-5 isoflurane% (טעון מראש) ועד מטוס כירורגית של הרדמה הוא הגיע. העכבר ממוקם על פלטפורמה ליד המכשיר LFP ואת הרכזת מלא מלוחים סטרילית. צינורות של המכשיר LFP עם זכר Luer-Lok מחובר מתאים Luer-Lok הנשי של הרכזת. חיה ממוקם על צידו פעם דפוס הנשימה קורות חיים נורמליים אבל לפני החיה להכרתו מלא (~ 2 דקות), המטוטלת של המכשיר LFP הוא שוחרר כדי לגרום הדופק יחיד של פציעה. חשוב לא לגרום לפגיעה בעוד החיה מורדמת מדי, מכיוון שזה עלול לגרום לכשל נשימתי ומוות. הלחץ המדויק של הדופק צריך להיות מוקלט. שלם, חיות דמה לעבור את כל אותם הליכים למעט הדופק נוזל בפועל לגרום לפציעה. בעלי חיים יש להסיר מיד מהמכשיר LFP והניח על גבו כדי לפקח על זמן ליישר רפלקס. אחרי העכבר יש התיישרה, ואז הוא הרדים בקצרה שוב הבטון הוסרו רכזת יחד ביד מהגולגולת. הקרקפת סגור אז עם Vetbond דבק רקמות (3M), תפר או סיכות. כל בקיעה של הדורה או חסימה של הרכזת הוא ציין. רכזת occluded יפיק פציעה נחלש גודל ידוע. חיה ממוקם בחזרה בכלוב על כרית חימום עד אמבולטורי ואז חזר הביתה הכלוב שלה. 3. הערכה של המנוע, התוצאות קוגניטיביים היסטולוגית מוטור גירעונות שנגרמו LFP ניתן לקבוע באמצעות בדיקת rotarod, אינדיקטור vestibulomotor משולבת פונקציה הסנסורית 21. כל בעלי החיים חייבים להיבדק לפני הפציעה כדי לקבוע קריאה המחקר ולאחר להסתגל העכברים כדי הפרדיגמה. עכברים מאומנים על המכשיר rotarod 3 פעמים ביום עם 1 שעות במרווחים intertrial יומיים לפני הפציעה. חביון לאזן על קוטר 36 מ"מ החיצוני, סיבוב מוט, שבו יש משטח גומי נמדד. עליות מהירות 4-40 סל"ד מעל מרווח 180 שניות. כל משפט מסתיים כאשר החיה נופלת rotarod. בנקודות זמן שונות בעקבות פציעה (בדרך כלל 1, 7 ו – 21 ימים), העכברים נבדקו שוב על המכשיר rotarod. הערכת הבדיקות rotarod לאחר פציעה מבוססת על עשרות בודדות יחסית latencies הבסיס שלהם 22. ההשהיה הממוצע ליפול של עכברים הוא נפגע בהשוואה לזו של עכברים דמה. LFP קוגניטיבי הפונקציה הבאה ניתן לבדוק על סט נפרד של עכברים באמצעות מבוך המים מוריס (עם אמא), מדד רגיש של זיכרון פוסט למידה ועבודה מרחבית במכרסמים 23. עכברים הם יתרגלו הפרדיגמה ונבדק התגובה הבסיסית באמצעות מבחן פלטפורמה גלוי 4 ימים לפני הפציעה. בריכה עגולה לבנים (1 מ 'קוטר) מלא במים ולא רעיל בצבע לבן. הפלטפורמה היא לנראים באמצעות דגל או סמן ואין רמזים חזותיים הם על הקירות. במשך 4 ניסויים, העכבר ממוקם ברבע השני של פלטפורמת גלוי, ואת חביון למצוא את הפלטפורמה נמדד. זמן מקסימלי למשפט הוא 60 שניות ועכבר נשאר או מושם על הבמה במשך 15 שניות בסוף כל משפט. מרווח intertrial הוא 5 דקות שבמהלכן עכבר חיממו על כרית חימום. הפלטפורמה היא עברה ברבע שונה עבור כל ניסוי וארבעה ניסויים מבוצעים. כדי להעריך את הלמידה, עכברים מאומנים על עם אמא באמצעות פלטפורמה מוסתר קבוע באחד 4 הרביעים בנקודות זמן שונות בעקבות פציעה (בדרך כלל 1, 7 ו – 21 ימים). רמזים שחור ולבן ממוקמים על הקירות. ברבע שבו העכבר ממוקם מגוונת pseudorandomly במהלך האימונים את הזמן כדי לאתר את פלטפורמת מוקלט. זמן מקסימלי למשפט הוא 60 שניות ועכבר נשאר או מושם על הפלטפורמה למשך 15 שניות וחיממה 5 דקות בין הניסויים. עכברים כפופים 8 משפטים / יום במשך 3 ימים רצופים. כדי להעריך שימור הזיכרון, החיות כפופים למשפט 60 שניות בדיקה למחרת האימון האחרון. במהלך המשפט בדיקה, הפלטפורמה היא להסיר כדי לקבוע את משך הזמן ושחה מרחק ברבע שבו פלטפורמת פעם. בסופו של דבר, מבחן פלטפורמה גלוי נעשית כדי לשלול מנוע אפשרי גירעונות חזותיים שהתפתחו לאחר פציעה. כדי לקבוע את ההשלכות של פגיעה היסטולוגית LFP, רקמה נקבע על ידי זלוף intracardial ב 0.9% NaCl ואחריו paraformaldehyde 4% בנקודות הזמן הרצוי לאחר פציעה. רקמה היא postfixed לילה בשעה 4 ° C ו cryoprotected אז ב -10% ו -30% סוכרוז פתרון והטבעה. קטעים סדרתי קפואים נחתכים על cryostat ומעובד באמצעות טכניקות immuohistochemical ו היסטולוגית שונים. 4. נציג תוצאות: הפגיעה הנגרמת על ידי המכשיר LFP ניתנת לשחזור מן החי מן החי, במיוחד עם הכשרה כירורגית מספיק. כדי לשמור על עקביות של הפגיעה, כמות הלחץ נשא את דורה על ידי המכשיר הוא במעקב. המטוטלת פוגעת מלא מים צילינדר אקרילי עם צינור בלחץ גבוה ו-Lok Luer הולם אשר מחובר לרכזת פציעה מודבקת באתר craniectomy על החיה (איור 1A). עבור פגיעה קלה עד בינונית, הזווית של המטוטלת נקבע כדי ליצור לחץ בטווח 0.9-2.1 atm ו אוסצילוסקופ מחוברים למגבר משמש כדי לחזות את הדופק לחץ (איור 1B). פגיעה מייצרת מגוון של ליישר פעמים רפלקס ואת התמותה הגוברים הקשורים בצקת ריאות. פציעה קלה נחשב זמן ליישר רפלקס מ 2 – 4 דקות ו 0 – שיעור התמותה של 5%. פגיעה מתונה נחשבת רפלקס ליישר זמן של 6 – 10 דקות ו 10 – שיעור התמותה 20%. יתר על כן, העכברים נתון LFP עשוי להפגין פוזה טוניק כי ניתן להצביע על התקף. תפיסה קשורה לעיתים קרובות עם הדורה בסכנה. ביחד, ממצאים אלה מראים כי הפגיעה היא גרימת נזק נוירולוגי. חיות שאם מחוברים למכשיר LFP אבל המטוטלת לא ישוחרר. כדי להמחיש את הנזק הנגרם על ידי LFP, יש לנו לבצע immunocytochemistry באמצעות נוגדנים אשר מכירים האסטרוציטים ומקרופגים הן אלו סוגי תאים הקשורים בתגובה לפציעה. גליה חלבון Fibrillary חומציים (GFAP) מכתים מגלה דבקת מוגברת לאורך הקורטקס באזור הפציעה WHereas עכברים דמה אינם מציגים astrocytosis מוגברת באתר המקבילה מתחת craniectomy (איור 2 א ', ב). באופן דומה, MAC1 מכתים מדגים מקרופאגים יותר סביב האתר של פציעה לעומת עכברים נתון ניתוח הדמה. בנוסף, יש נזק פיזי לעיתים קרובות רקמת קליפת המוח לעין בעכברים נתון LFP אך לא דמה עכברים (איור 2 ג, ד). בדיקות ההתנהגות הבאים LFP קלה ניתן להשתמש כדי להעריך את התוצאות הן קוגניטיבית ומוטורית. עם אמא משמש כדי לקבוע השפעות על למידה וזיכרון. באמצעות רמזים חזותיים בחדר בדיקות, עכברים דמה הפך במהירות יעילה יותר באיתור פלטפורמה עם כל יום של אימונים עוקבים במבוך מים. עכברים נתון LFP קלה להימשך זמן רב יותר כדי לאתר את פלטפורמת מוסתר על היומיים הראשונים של בדיקות דמה ביחס לעכברים, אבל אז מופיעים ללמוד את המשימה ביום השלישי (איור 3A). ממצאים אלה מראים כי הפגיעה מפחית את הקצב שבו העכברים יכולים לרכוש למידה מרחבית. כדי לקבוע את ההשפעה של הפגיעה על שימור זיכרון, במשפט מבוצעת בדיקה 1 יום אחרי האימון האחרון. עכברים שאם לבלות יותר זמן ברבע היעד לעומת העכברים נתון LFP קלה טוען כי הפציעה השפיעה על היכולת של העכברים לזכור את המיקום של איפה פלטפורמה המשמשת לישיבה (איור 3B). על מנת להעריך תפקוד של תנועה, עכברים נוסו על המכשיר rotarod. עכברים נתון LFP קלה יש החביון הממוצע קצר יותר ליפול לעומת העכברים דמה 1, 7 ו – 21 ימים שלאחר פציעה (dpi) (איור 3 ג). נתונים אלה מראים כי עכברים פצועים יש לקויי vestibulomotor משולבת פונקציה הסנסורית. 1. איור LFP המכשיר עקבות נציג אוסצילוסקופ המתקבל במהלך הפציעה. א) רכיבים של המכשיר LFP הם: המטוטלת קבוע לעמוד ולהגדיר בזווית קבועה מראש, כדי לספק את הכוח הרצוי, מים מלאים גליל אקרילי עם צינור בלחץ גבוה וכן ראוי זכר Luer-Lok המצורפת, מגבר, ו אוסצילוסקופ. ב) נציג שמץ של דופק לחץ אוסצילוסקופ. ערך שיא ל-השיא הוא 2.16 וולט המעיד על לחץ של atm 1.47. איור 2. דבקת משופרת תגובה דלקתית LFP הבא מדגים את מידת הפציעה. סעיפים רוחבי קפואים (20μm) דרך המוח של עכבר נתון דמה ניתוח (A, C) או פציעה LFP (B, D) 7 ימים שלאחר פציעה (dpi). תמונות קליפתיים נלקחים במוקד craniectomy. (A, B) רקמה צבעונית עם נוגדן לזהות האסטרוציטים. גליה Fibrillary חומציים (GFAP) חלבון נוגדן (MAB360, Chemicon, 1:400) מגלה מספר גבוה יותר של האסטרוציטים ברחבי קליפת המוח של העכבר נתון פציעה LFP (חיצים) לעומת ניתוח הדמה. נוגדן הוא משני עז אנטי העכבר 594 (1:1000). (ג ד) רקמה צבעונית עם נוגדן לזהות מקרופאגים. MAC1 נוגדן (MAC1 אלפא השרשרת CD11b, BD Biosciences, 01:50) מגלה macrophges יותר ו / או מופעל microglia סביב האתר של פגיעה בקליפת המוח (חיצים) לעומת ניתוח הדמה. נוגדנים משני הוא עכברוש עז אנטי CY3 (01:50). בר סולם = 200μm ב A ו-B, 100μm ב C ו-D איור 3. בדיקות ההתנהגות הבאים LFP קלה מדגים ליקויים נפצעו לעומת עכברים דמה. א) עכברים נתון LFP קלה להימשך זמן רב יותר ללמוד את המשימה של מציאת פלטפורמה עם אמא מאשר עכברים דמה. שאם לעומת LFP (שד 'שניות ± SEM) 1 יום 34.21 ± 3.02 לעומת 38.64 ± 2.63; 2 ביום 24.52 ± 2.84 לעומת 2.11 ± 27.21, יום 3 22.47 ± 2.00 לעומת 2.52 ± 22.08 (1 dpi, n = 9 דמה, 10 LFP) . ב) עכברים נתון LFP קל להשקיע פחות זמן ברבע היעד במהלך המשפט 24 שעות בדיקה לאחר האימון האחרון ביחס לעכברים עם אמא דמה (21 dpi, n = 10). ג) עכברים נתון LFP קל ליפול המכשיר rotarod מוקדם יותר מאשר עכברים דמה (1, 7, ו – 21 dpi, n = 5 מזויף, 8 LFP). ברים שגיאה מייצגים SE.