Боковые ударные жидкости: Модель черепно-мозговой травмой у мышей

1. Удаление фрагментов костей черепа Стерильные хирургические сайт подготовлен в том числе стереотаксической инструмент выравнивания (Kopf Instruments) для мышек с анестезией мыши газ головой держатель (Kopf Instruments) связаны с анестезией машина с O 2 флеш (Паркленд Scientific), чтобы обеспечить непрерывное вдыхание изофлуран во время операции . Потепление площадку хранится при температуре 37 ° C находится под указателем мыши во время операции. Операционный микроскоп и источник света не требуется. Экспериментатор должен носить халат, хирургическую маску, ноги покрытие, перчатки и головной убор. Все инструменты и материалы, которые контактируют с места операции должны быть стерилизованы. Травмы концентратор, состоящий из женщин конце Луер-лок, создан отрезав металлический конце 20 г 1 ½ "иглы (Becton Dickinson) с лезвием бритвы. Хаб должны быть сокращены с небольшой уклон и имеют приблизительно 3 мм внутренний диаметр отверстия. трепан (см. шаг 1,10) может быть использован для измерения и изготовить травмы центром правильного диаметра. Один концентратор требуется на одно животное. хаб будет прикреплен к черепу и подключен к LFP Устройство для доставки импульс давления. Твердые шнур нейлона (1,7 мм в диаметре, например сорняков линии триммер) разрезается на ~ 1 мм диск с помощью лезвия бритвы. Опять же, один диск требуется на одно животное. Это используется для стабилизации трепан при выполнении удаление фрагментов костей черепа (см. шаг 1,10). Мыши могут быть любого штамма и возраста (у нас в основном используют C57BL / 6 в возрасте от 1 – 9 месяцев). Мышь взвешивается и анестезии в небольшую камеру индукции (предварительно заполнены 4-5% изофлуран в 100% O 2) в течение не менее 1 минуты. Для упреждающей анальгезии, инъекции buprenorphrine (0,1 мг / кг) дается внутрибрюшинно и мыши помещается обратно в камеру еще на минуту. Болеутоляющие режима должна быть подтверждена путем проведения консультаций с местными использование животных и ухода комитета. Волосы на верхней части головы мыши отделана как можно ближе к коже, насколько возможно. Мышь позиционируется в стереотаксической инструмент выравнивания оснащены укуса покрытием предназначены для управления летучих анестезии газа (Kopf Instruments). Уровень изофлуран газа снижается до 2%, или на эффект. Дыхание скорость контролируется визуально во время операции. Другие физиологические параметры, такие как газы крови (р O 2, р CO 2), рН крови и артериальное давление можно измерить с помощью соответствующего оборудования во время процедуры. Искусственные слезы смазка глазная мазь наносится на глаза мышей с помощью ватного аппликатора, чтобы держать их от высыхания. Повидон-йод наносят на кожу между глаз и шеи с помощью ватного аппликатора затем 70% спирта. Применение повидон-йод и спирт повторяется в общей сложности 3 раза. Средней линии разрез кожи головы производится от глаз до шеи с помощью скальпеля (# 15 лезвие) и кожи убирается с небольшим зажимы бульдога (Fine Инструменты наук # 18050-28) подвергать черепа и обеспечивают четкое операционного поля. Бульдог зажимы свисают боковые края черепа. Актуальные анестезии бупивакаин (0,025% в физиологическом растворе) наносится на череп с аппликатором хлопка и фасции Царапины от черепа с кончика стоматологического инструмента или кости скребком (например, тонкие инструменты, науки, # 10075-16). Перманентный маркер используется для обозначения черепа на полпути между брегмы и лямбда, а также между сагиттального шва и бокового гребня над правым полушарием (~ 2 мм право средней линии). Капли Loctite цианоакрилат клей (Loctite Tak Пак 454) ставится в пластиковый весят лодке и боковые схватив щипцами (Fine инструменты Наука, Дюмон # 6) используются для падения диска сорняков твердых шнур нейлона (см. 1.3 выше) в клей, а затем нажмите диск на след на черепе. Через одну-две капли Loctite Ускоритель поставляется на верхней части диска с помощью шприца 1 мл и 26 3 / 8 G игла вызывает упрочнение клея. Испытание приверженность диск череп прежде чем продолжить. Место 3 мм, внешний диаметр трепан (Научно-исследовательский инструментарий магазин, Университет Пенсильвании) над диском и спина по часовой стрелке, пока вы не прорезать черепа. Проверьте прогресс в трепан часто, чтобы избежать бурения слишком далеко в черепе и нарушения оболочки. Там будет истончение черепа по периметру диска и черепа лоскут будет чувствовать себя свободно при нажатии слегка. Место стоматологических инструментов параллельного / горизонтально на поверхности черепа, чтобы вырвать под черепом и поднимите костный лоскут вверх. Отсоедините кости черепа щипцами. Если есть небольшое количество кровотечения, без компромиссов твердой мозговой оболочки, использование хлопка аппликатор, чтобы оказать давление, пока кровотечение не остановится и не допустить кости попадания пыли на твердой мозговой оболочки. Тем не менее, если есть нарушения в твердой мозговой оболочки, что грыжа видна, животное должно быть исключено из эксперимента гуманной эвтаназии. Этот шаг требует достаточной практикидля достижения хирургических навыков требуется. Использование щипцов, поддерживать травмы центра в положение над удаление фрагментов костей черепа в черепе так, что смещение центра совмещена с кривизной черепа (то есть больше краю концентратора лежит вблизи боковых гребня черепа). Между тем, используя деревянную палку, разрезать под углом лезвие, чтобы иметь острый кончик, нанесите гель супер клей вокруг внешних краев концентратор с противоположной стороны и стабилизировать центром, пока она прикреплена вертикально над отверстием. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не получить клея в верхней части оболочки. Клей на длительность вызовет ослабление травмы. С помощью небольшой бумажный стаканчик, смешать метил-метакрилат стоматологических акриловых (Jet Acrylic Liquid с пермскими выровнять / Ремонт Ресин, Шейн Батлер), чтобы создать вязкий раствор. Используйте 1 мл шприц с иглой не применять цемент по всему травма хаба. Цемент должен покрыть дно 2 мм травмы центром, а также окружающие подвергаются черепа. Череп швы герметизируются с цементом, чтобы жидкости болюсно от травмы остается в полости черепа. Заполнить центр стерильным 0,9% NaCl (физиологический раствор) с помощью шприца и иглы притупляются. Солевой будет держать влажной оболочки во время фазы восстановления. Кроме того, если травма хаб не остается заполнены, что будет означать утечку в центр связи с черепом и нового центра должна быть приложена. Мышь должна быть предоставлена ​​инъекции 0,25 мл стерильного физиологического раствора IP, удаляются из стереотаксического прибора выравнивание и поместили в пустую клетку без крышки провод бар на потепление пластины. Поместите некоторые hydragel на дно клетки и позволяют мышам восстановить в течение 1-2 часов. 2. Индукция травмы Включите осциллограф (Tektronix TDS 1001B, двухканальный осциллограф Digi 40 МГц, 500Ms.s) и усилителем (травма индуктора Датчик давления усилителя), который подключен к устройству LFP. Убедитесь, что устройство LFP (Custom Дизайн и изготовление, Virginia Commonwealth University) и высокого давления, трубы (длина 41 см, объем 2 мл, Бакстер # 2C5643), подключенных к ней заполнены стерильной водой и без пузырьков воздуха. В конце трубка мужчина Луер-лок кусок. С Луер-лок конца трубки закрыты, доставить испытательных импульсов, выпустив маятника. Устройство следует загрунтовать, поставляя около 10 испытательных импульсов. Убедитесь, что маятник дает гладкий сигнал на осциллограф и усилитель. Зашумленного сигнала указывает воздуха в системе, которые должны быть удалены до предоставления травмы импульса. Длительность импульса должна быть около 20 мс. Преобразователь усилитель поставляется с устройством LFP откалиброван так, что 10 мВ = 1,0 фунтов на квадратный дюйм (PSI). Один атмосферы (ATM) = 14,7 PSI. Травма давления поставляются, как правило, в диапазоне 0,9 – 2,1 атмосфер, чтобы произвести ряд рефлекса раза и увеличение смертности, связанных с отеком легких. Мягкий травмы считается рефлекса время 2 – 4 мин и 0 – 5% смертности. Причинение средней тяжести вреда считается время рефлекса 6 – 10 мин и 10 – 20% смертности. Если необходимо, отрегулируйте угол маятника для увеличения или уменьшения интенсивности импульса. Угол исходное положение маятника составляет примерно 10 градусов. После корректировки LFP устройства, не забудьте открыть Луер-Лок конце трубки. Мышь находится в 4-5% изофлуран камеры анестезией (без предварительной зарядки) до хирургической анестезии плоскости будет достигнута. Мыши помещается на платформу рядом с LFP устройства и концентратор заполняется стерильным физиологическим раствором. Трубок LFP устройство с мужчинами Луер-лок прилагается к женскому Луер-лок установку концентратора. Животное находится на его стороне и как только возобновится нормальное дыхание картины, но до полного восстановления животного сознания (~ 2 мин), маятник устройство LFP выпущен вызывает одиночный импульс травмы. Важно, чтобы не вызывать травмы в то время как животное слишком анестезии, как это может привести к дыхательной недостаточности и смерти. Точное давление пульс должен быть записан. Пострадал, притворство животные проходят все те же процедуры, за исключением фактического импульса жидкости, чтобы вызвать травмы. Животное должно быть немедленно удалены с устройства LFP и размещен на его обратно на монитор рефлекса времени. После мышь исправила сама, она затем кратко наркозом снова и цемента и ступицы удаляется вместе с черепом вручную. Скальпа затем закрывается с Vetbond ткани клей (3М), шовный или скоб. Любая грыжа оболочки или окклюзии концентратор отмечено. Окклюзии центр будет производить ослабленный травмой неизвестной величины. Животное помещается обратно в клетку на площадку до потепления амбулаторно, а затем вернулся в родную клетку. 3. Оценка двигателя, познавательные и гистологические результаты Движениетор дефицит вызван LFP можно определить с помощью теста rotarod, показатель интегрированных vestibulomotor и сенсомоторной функции 21. Все животные должны быть проверены до травмы, чтобы определить базовые чтение и акклиматизироваться мышей парадигмы. Мыши проходят обучение на устройство rotarod 3 раза в день с 1-часовых интервалов для intertrial за два дня до травмы. Задержки балансировать на 36-мм наружный диаметр, вращающемся стержне, который имеет резиновую поверхность измеряется. Скорость увеличивается с 4 до 40 оборотов в минуту в течение интервала 180 сек. Каждое испытание заканчивается, когда животное падает rotarod. В разные моменты времени после травмы (как правило, 1, 7 и 21 дней), мышей снова протестирован на устройстве rotarod. Оценка rotarod тестов после травмы на основе индивидуальных значений по отношению к их базовой задержки 22. Среднее время ожидания до падения ранения мышей по сравнению с мышами обман. Когнитивные функции после LFP могут быть проверены на отдельный набор мышах лабиринт Морриса Вода (МВМ), с большой точностью оценивать посттравматических пространственной памяти обучения и работы на грызунах 23. Мыши приспособиться к парадигме и проверены на базовый ответ, используя видимые тестовой платформы 4 дня до травмы. Белый круговой бассейн (1 м в диаметре) заполнен водой и нетоксичных белой краской. Платформа становится видимым использовании флага или маркер и не визуальные подсказки на стенах. Более 4 испытания, мышь находится в квадранте противоположным видимых платформы, и задержки, чтобы найти платформу измеряется. Максимальное время судебного разбирательства 60 сек и мышь остается или помещают на платформу на 15 секунд в конце каждого испытания. Intertrial интервал составляет 5 минут в течение которого мыши нагревается на грелку. Платформа перемещается в другой квадрант для каждого испытания и четыре испытания выполняются. Для оценки обучения, мышей обучаются на MWM с помощью скрытой платформы фиксируется в одном из 4 квадрантов в различные моменты времени после травмы (как правило, 1, 7 и 21 дней). Черно-белый сигналы размещаются на стенах. Квадрант, в котором мышь размещенных псевдослучайно разнообразны протяжении подготовки и времени, чтобы найти платформу записывается. Максимальное время судебного разбирательства 60 сек и мышь остается или помещают на платформу в течение 15 сек и нагревают в течение 5 минут между испытаниями. Мыши подвергались 8 исследований / день в течение 3 дней подряд. Для оценки сохранение данных в памяти, животные подвергаются суду 60 зонд с дня, следующего за последние тренировки. Во время зонд суда, платформы удаляется, чтобы определить потраченное время и расстояние плавал в квадранте, где платформа раньше. Наконец, видимые тестовой платформы будет сделано, чтобы исключить возможные двигательного и зрительного дефицита, который разработан после травмы. Для определения гистологического последствия LFP травмы, ткани фиксируется intracardial перфузии в 0,9% NaCl, затем 4% параформальдегида в нужное время очков после травмы. Ткань постфиксами течение ночи при 4 ° С и затем cryoprotected в 10% и 30% сахарозы и внедрения решения. Замороженные серийных срезов разрезаются на криостате и обработаны с использованием различных immuohistochemical и гистологических методов. 4. Представитель Результаты: Травмы индуцированной устройство LFP воспроизводится от животного к животному, в частности, с достаточной хирургической подготовки. Чтобы сохранить целостность травмы, количество давления доставлены оболочки на устройство находится под контролем. Маятник ударов заполненные водой акриловую цилиндр высокого давления, насосно-компрессорные и Луер-лок установки, которая связана с травмой центром прикреплены к удаление фрагментов костей черепа сайта на животных (рис. 1А). Для легкой и средней тяжести, угол маятника устанавливается для создания давления в пределах от 0,9 – 2,1 атм и осциллограф подключен к усилителю используется для визуализации импульс давления (рис. 1В). Травма производит целый ряд рефлекса раза и увеличение смертности, связанных с отеком легких. Мягкий травмы считается рефлекса время 2 – 4 мин и 0 – 5% смертности. Причинение средней тяжести вреда считается время рефлекса 6 – 10 мин и 10 – 20% смертности. Кроме того, мышей, подвергнутых воздействию LFP могут проявлять тоник позерство, что может свидетельствовать о конфискации. Захват часто ассоциируется с угрозой оболочки. Вместе взятые, эти результаты показывают, что травма вызывает неврологические повреждения. Шам животных связаны с устройством LFP но маятник не выпустили. Для визуализации повреждений, вызванных LFP, мы выполнили иммуноцитохимии с использованием антител, которые распознают астроциты и макрофагов оба из которых являются типы клеток связано с ответом на травму. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) окрашивание показывает увеличился глиоз всей коры в районе травмы WHereas фиктивный мышей не отображаются увеличился astrocytosis в эквиваленте сайт ниже удаление фрагментов костей черепа (рис. 2а, б). Точно так же MAC1 окрашивание демонстрирует более макрофаги окружающих месте повреждения по сравнению с мышей, подвергавшихся операции обман. Кроме того, часто физические повреждения корковой ткани видны в мышей, подвергнутых воздействию LFP, но не в мнимой мышей (рис. 2в, г). Поведенческие тестирование следующей мягкий LFP могут быть использованы для оценки как когнитивные и моторные результатов. МВМ используется для определения последствий для обучения и памяти. Использование визуальных подсказок в тестировании комнате, притворство мышей быстро стало более эффективным при поиске платформы с каждым последующим днем ​​обучения в водном лабиринте. Мыши подвергались мягкий LFP занять больше времени, чтобы найти скрытые платформы на первых двух дней тестирования по отношению к мнимой мышей, но затем появляются, чтобы узнать задание на третий день (рис. 3А). Эти результаты показывают, что травма снижает скорость, с которой мышь может приобрести пространственного обучения. Чтобы определить, последствия травм на сохранение данных в памяти, датчик суда осуществляется через 1 день после последней тренировочной сессии. Шам мышей проводить больше времени в целевой сектор по сравнению с мышей, подвергнутых воздействию мягкого LFP предположить, что травма повлияла на способность мышей вспомнить место, где платформа, используемая для проживания (рис. 3В). Для оценки двигательной функции, мыши были протестированы на устройство rotarod. Мыши подвергались мягкий LFP имеют более короткие среднее время ожидания падать по сравнению с мнимой мышей на 1, 7 и 21 день после травмы (точек на дюйм) (рис. 3С). Эти данные свидетельствуют о том, что ранения мышах нарушением интегрированной vestibulomotor и сенсомоторной функции. Рисунок 1. LFP устройства и представитель след от осциллографа, полученные в ходе травмы. ) Компоненты устройства LFP являются: маятник крепится к подставке и под углом предопределено обеспечить желаемые силы, заполненных водой акриловую цилиндра высокого давления труб и мужчины Луер-лок установки прилагается, усилитель, и осциллограф. Б) представитель след импульса давления от осциллографа. Пик-пик значения 2,16 вольт указывает давление 1,47 атм. Рисунок 2. Расширенные глиоз и воспалительные реакции после LFP демонстрирует высокую степень травмы. Замороженные поперечного сечения (20 мкм) через мозг мышей подвергали мнимого хирургии (А, С) или LFP травмы (B, D) 7 дней после травмы (точек на дюйм). Корковая изображения взяты в эпицентре удаление фрагментов костей черепа. (А, В) Ткань окрашивали антителами для выявления астроцитов. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) антител (MAB360, Chemicon, 1:400) показывает большее число астроцитов всей коре мыши подвергались LFP травмы (стрелки) по сравнению с хирургии обман. Вторичные антитела антимышиного 594 (1:1000). (C. D) Ткань окрашивали антителами для выявления макрофагов. MAC1 антител (MAC1-альфа цепи CD11b, BD Biosciences, 1:50) показывает больше macrophges и / или активированных микроглии вокруг места повреждения в коре головного мозга (стрелки) по сравнению с хирургии обман. Вторичные антитела козьи антитела крысы Cy3 (1:50). Шкала бар = 200 мкм в А и В, 100 мкм в С и D. Рисунок 3. Поведенческие тестирование следующей мягкий LFP демонстрирует дефицита ранения по сравнению с мнимой мышей. ) Мыши подвергались мягкий LFP занять больше времени, чтобы узнать задача найти платформу в MWM, чем мыши, обман. Шам против LFP (пр. секунд ± SEM) 1 день 34,21 ± 3,02 против 38,64 ± 2,63; 2 день 24,52 ± 2,84 против 27,21 ± 2,11; 3 день 22,47 ± 2,00 против 22,08 ± 2,52 (1 дюйм, п = 9 обман, 10 LFP) . Б) мышей, подвергнутых воздействию мягкого LFP тратить меньше времени в целевом квадранте во время зонд суда 24 часа после последнего обучения в MWM относительно мнимой мышей (21 точек на дюйм, п = 10). С) Мыши подвергались мягкий LFP упасть rotarod устройство раньше, чем притворство мышей (1, 7 и 21 точек на дюйм, п = 5 обман, 8 LFP). Планки погрешностей представляют SE.