Percusión fluido lateral: Modelo de Lesión Cerebral Traumática en ratones

1. Craniectomía Un sitio quirúrgico estéril se prepara como un instrumento de alineación estereotáxica (Instrumentos Kopf) en ratones con un depósito de gas del ratón cabeza anestesia (Kopf Instruments) conectado a una máquina de anestesia con O 2 al ras (Parkland Científica) para permitir la inhalación continua de isoflurano durante la cirugía . Una almohadilla de calentamiento se mantuvo a 37 ° C se coloca bajo el ratón durante la cirugía. Un microscopio quirúrgico y fuente de luz que se necesita. El experimentador debe usar una bata de laboratorio, una mascarilla quirúrgica, que cubre el pie, guantes y cubrirse la cabeza. Todas las herramientas y materiales que en contacto con el sitio quirúrgico debe ser esterilizado. Un centro de lesión, que consiste en la final femenina de un Luer-lok, es creado por el corte de la punta de metal de un G-20 de 1 ½ "de aguja (Becton Dickinson), con una cuchilla de afeitar. El centro debe ser cortado con una ligera inclinación y tener una abertura de aproximadamente 3 mm de diámetro interior. El trépano (véase el paso 1.10) se puede utilizar para medir y fabricar un centro de la lesión del diámetro correcto. Un hub es requerido por animal. El centro se adjunta en el cráneo y conectada a la LFP dispositivo para entregar el pulso de presión. Cuerda de nylon sólido (1,7 mm de diámetro, por ejemplo, la línea de trimmer de malas hierbas) se corta en discos de aproximadamente 1 mm de espesor con una hoja de afeitar. Una vez más, un disco es necesario por animal. Esto se utiliza para estabilizar el trépano en el desempeño de la craniectomía (véase el paso 1.10). Los ratones pueden ser de cualquier cepa y edad (que utilizan principalmente C57BL / 6 años de edad 1 a 9 meses). El ratón se pesa y anestesiados en una cámara de inducción pequeños (pre-llenado con 5.4% de isoflurano en el 100% O 2) por lo menos durante 1 minuto. Para la analgesia preventiva, una inyección de buprenorphrine (0,1 mg / kg) se administra por vía intraperitoneal y el ratón se vuelve a colocar en la cámara durante un minuto. El régimen analgésico deber ser confirmada por la consulta con el uso de animales locales y el comité de atención. El pelo en la parte superior de la cabeza del ratón se corta lo más cerca posible de la piel. El mouse se coloca en un instrumento de alineación estereotáxica equipado con un bocado plateado diseñado para administrar la anestesia de gas volátil (Kopf Instruments). El nivel de gas isoflurano se reduce al 2% o al efecto. La frecuencia respiratoria se controla visualmente durante la cirugía. Otros parámetros fisiológicos, tales como los gases en sangre (p O 2, CO 2 p), pH de la sangre o la presión arterial se puede medir con equipo apropiado, durante el procedimiento. Lubricante de lágrimas artificiales ungüento para los ojos se pone en los ojos del ratón utilizando un aplicador de algodón para evitar que se sequen. Povidona yodada se aplica a la piel entre los ojos y el cuello con un aplicador de algodón seguido por 70% de alcohol. La aplicación de povidona yodada y el alcohol se repite para un total de 3 veces. Una incisión de la línea media del cuero cabelludo se hace desde los ojos hasta el cuello con un bisturí (# 15 hojas) y la piel se retractó con bulldogs pequeños (Herramientas Artes Ciencia # 18050-28) para exponer el cráneo y proporcionar un campo quirúrgico claro. Los bulldogs cuelgan de los bordes laterales del cráneo. Tópico anestésico bupivacaína (0,025% en solución salina) se aplica en el cráneo con un aplicador de algodón y la fascia se raspa el cráneo con la punta de la herramienta dental o un raspador de hueso (por ejemplo, herramientas, Ciencia Artes, # 10075-16). Un marcador permanente se utiliza para marcar el cráneo a medio camino entre bregma y lambda, y entre la sutura sagital y la cresta lateral sobre el hemisferio derecho (~ 2 mm derecha de la línea media). Una gota de pegamento de cianoacrilato de Loctite (Loctite Tak Pak 454) se coloca en un plástico pesan unas pinzas barco y parte de agarre (Herramientas Artes Ciencia, Dumont n º 6) se utilizan para sumergir un disco de cable de nylon de malezas sólida (ver 1.3) en el pegamento y luego presione el disco en la marca en el cráneo. Una o dos gotas del acelerador de Loctite se entrega en la parte superior del disco con una jeringa de 1 ml y 26 3.8 G aguja a causa del endurecimiento de la cola. Prueba de la adherencia del disco en el cráneo antes de proceder. Coloque un trépano 3 mm de diámetro exterior (Tienda de Investigación de Instrumentación de la Universidad de Pennsylvania) sobre el disco y gira hacia la derecha hasta que haya cortado a través del cráneo. Comprobar el progreso de la trefina con frecuencia para evitar la perforación demasiado lejos en el cráneo y el incumplimiento de la duramadre. Habrá un adelgazamiento de la calavera de todo el perímetro del disco y la tapa del cráneo se siente suelto cuando se presiona ligeramente. Coloque la herramienta dental paralelo / horizontal a la superficie del cráneo para hacer fuerza en el cráneo y levantar el colgajo óseo arriba. Separar el hueso del cráneo con unas pinzas. Si hay una pequeña cantidad de sangrado, sin compromiso de la duramadre, use un aplicador de algodón para aplicar presión hasta que el sangrado se detenga y evitar que el polvo de hueso de conseguir en la duramadre. Sin embargo, si hay una brecha en la duración de tal manera que la hernia se puede ver, el animal debe ser eliminado del experimento por la eutanasia. Este paso requiere la suficiente prácticapara lograr la destreza quirúrgica necesaria. Con unas pinzas, mantener el centro de una lesión en la posición sobre la craniectomía en el cráneo por lo que el sesgo del cubo está alineado con la curvatura de la cabeza (es decir, el borde más largo del cubo se encuentra cerca de la cresta lateral del cráneo). Mientras tanto, utilizando un palo de madera, cortado en un ángulo con una hoja de afeitar para tener una punta afilada, aplicar el gel de pegamento alrededor de los bordes exteriores del centro con la mano opuesta y estabilizar el cubo hasta que se fija en posición vertical sobre el agujero. Se debe tener cuidado de no conseguir el pegamento en la parte superior de la duramadre. Pegamento en la dura causará una atenuación de la lesión. El uso de un vaso de papel pequeño, mezcle el metil-metacrilato acrílico dental (líquido a chorro de acrílico con Revestimiento de Perm / Reparación de resina, Butler Schein) para crear una solución viscosa. Use una jeringa de 1 cc sin aguja para aplicar el cemento en todo el centro de la lesión. El cemento debe cubrir la parte inferior de 2 mm del cubo lesión, así como el cráneo expuesto rodea. Las suturas del cráneo se cierran con el cemento para asegurar que el bolo de la lesión se mantiene dentro de la cavidad craneal. Llenar el cubo con estéril al 0,9% de NaCl (solución salina) con una jeringa y aguja roma. La solución salina será mantener la humedad de duración durante la fase de recuperación. Además, si el centro de una lesión no se queda lleno, que nos indicará una fuga en la conexión de cubo en la cabeza y un nuevo centro que se adjunta. El ratón se debe dar una inyección de 0,25 ml de solución salina estéril IP, retirado de la alineación instrumento estereotáxico y se coloca en una jaula vacía sin tapa barras de alambre en una placa de calentamiento. Coloque un poco de HydraGel en la parte inferior de la jaula y permitir que los ratones a recuperarse durante 1-2 horas. 2. La inducción de lesiones Encienda el osciloscopio (Tektronix TDS 1001B, de dos canales del osciloscopio de almacenamiento Pieza de 40 MHz, 500Ms.s) y el amplificador (inductor Trauma amplificador de presión del transductor) que está conectado al dispositivo LFP. Confirme que el dispositivo LFP (Diseño y Fabricación de encargo, Virginia Commonwealth University) y el tubo de alta presión (longitud de 41cm, el volumen de 2 ml, Baxter # 2C5643) conectados a él se llenan con agua estéril y libre de burbujas de aire. Al final de la tubería es un hombre Luer-lok pieza. Con el fin Luer-lok del tubo cerrado, entregar los impulsos de prueba por la liberación del péndulo. El dispositivo debe ser preparado por la entrega de aproximadamente 10 pulsos de prueba. Confirme que el péndulo da señal sin problemas en el osciloscopio y el amplificador. Una señal de ruido que hay aire en el sistema que debe ser removido antes de entregar el pulso de una lesión. La duración del pulso debe ser de 20 mseg. El amplificador transductor se suministra con el dispositivo LFP está calibrado de tal manera que 10 mV = 1,0 libras por pulgada cuadrada (PSI). Una atmósfera (ATM) = 14.7 PSI. Presiones lesiones suelen ser entregados en el rango de 0,9 a 2,1 atmósferas para producir una gama de corregir los tiempos y un reflejo de aumento de la mortalidad asociada con edema pulmonar. Lesión leve se considera un tiempo de los reflejos de 2 a 4 min y un 0 – 5% de tasa de mortalidad. Lesiones leves o moderadas se considera un momento reflejo de enderezamiento de 6 – 10 minutos y un 10 – 20% de tasa de mortalidad. Si es necesario, ajustar el ángulo del péndulo para aumentar o disminuir la intensidad del pulso. El ángulo de la posición inicial del péndulo es de aproximadamente 10 grados. Después de ajustar el dispositivo LFP, asegúrese de abrir el extremo Luer-Lok de la tubería. El ratón es colocado en la cámara de anestesia 4-5% isoflurano (pre-pago) hasta que un plano quirúrgico de anestesia se alcanza. El ratón es colocado en una plataforma junto al dispositivo LFP y el cubo se llena con solución salina estéril. El tubo del dispositivo LFP con un macho Luer-lok se adjunta a la hembra Luer-Lok de la maza. El animal se coloca en su lado y una vez que se reanuda el patrón de respiración, pero antes de que el animal recupere la consciencia completa (~ 2 min), el péndulo de la LFP el dispositivo se libera para hacer un solo pulso de la lesión. Es importante no provocar la lesión, mientras que el animal es demasiado anestesiados ya que puede causar insuficiencia respiratoria y muerte. La presión exacta del pulso debe ser registrada. Ilesos, los animales sham someterse a todos los mismos procedimientos que con la excepción de que el pulso real del líquido para provocar daño. El animal debe ser removido inmediatamente de que el dispositivo LFP y se coloca en la espalda para controlar el tiempo de los reflejos. Después de que el ratón se ha corregido, se hizo una breve anestesiados de nuevo y el cemento y el centro eliminado junto con el cráneo con la mano. El cuero cabelludo se cierra con tejido Vetbond adhesivo (3M), hilo de sutura o grapas. Cualquier hernia de la dura o la oclusión del centro se observa. Un centro de oclusión se produce una lesión atenuada de magnitud desconocida. El animal se coloca de nuevo en la jaula sobre una almohadilla de calentamiento hasta el ambulatorio y luego regresó a su jaula. 3. Evaluación de motor, los resultados cognitivos e histológicos El motor déficit causado por LFP puede determinarse mediante la prueba de rotarod, un indicador de vestibulomotor integrado y funciones sensoriales y motrices 21. Todos los animales deben ser probados antes de la lesión para determinar una lectura de referencia y se adapte a los ratones con el paradigma. Los ratones son entrenados en el dispositivo rotarod 3 veces al día con 1 hora de intervalos entre ensayos para los dos días antes de la lesión. La latencia de mantener el equilibrio sobre un diámetro exterior de 36 mm, varilla giratoria, que tiene una superficie de goma se mide. La velocidad aumenta de 4 a 40 rpm en un intervalo de 180 segundos. Cada ensayo termina cuando el animal se cae de la rotarod. En diferentes momentos después de la lesión (por lo general 1, 7 y 21 días), los ratones están de nuevo a prueba en el dispositivo rotarod. Evaluación de las pruebas rotarod después de la lesión se basa en las puntuaciones individuales en relación con sus latencias de referencia 22. La latencia promedio de caída de los ratones lesionados se compara con la de los ratones farsa. LFP función cognitiva siguiente puede ser probado en un grupo separado de ratones utilizando el laberinto acuático de Morris (MWM), una medida sensible de la memoria espacial postraumático aprender y trabajar en los roedores 23. Los ratones están aclimatados al paradigma y probado para la respuesta de línea de base mediante la prueba de plataforma visible 4 días antes de la lesión. Una piscina circular blanca (1 m de diámetro) se llena de agua y la pintura no tóxica blanca. La plataforma se hace visible con una bandera o marcador y no las señales visuales se encuentran en las paredes. Más de 4 ensayos, el ratón es colocado en el cuadrante opuesto al de la plataforma visible, y la latencia para encontrar la plataforma mide. Tiempo de prueba máximo es 60 segundos y el ratón se mantiene o se coloca en la plataforma durante 15 segundos al final de cada ensayo. El intervalo entre ensayos es de 5 minutos durante el cual se calienta con el ratón sobre una almohadilla térmica. La plataforma se mueve a un cuadrante diferente para cada ensayo y cuatro ensayos se realizan. Para evaluar el aprendizaje, los ratones son entrenados en el uso de MWM una plataforma oculta fija en uno de los 4 cuadrantes en diversos puntos temporales después de una lesión (por lo general 1, 7 y 21 días). Señales en blanco y negro se colocan en las paredes. El cuadrante en el que se coloca el ratón es seudo variado a través de la capacitación y el tiempo para localizar la plataforma se registra. Tiempo de prueba máximo es 60 segundos y el ratón se mantiene o se coloca en la plataforma durante 15 segundos y se calienta durante 5 minutos entre las pruebas. Los ratones son sometidos a ensayos 8 / día durante 3 días consecutivos. Para evaluar la retención de la memoria, los animales son sometidos a un juicio de la sonda 60 segundos al día siguiente del último entrenamiento. Durante el juicio de la sonda, la plataforma se retira para determinar el tiempo transcurrido y la distancia de nado en el cuadrante donde la plataforma que solía ser. Por último, una plataforma de prueba visible se hace para descartar posibles motor y el déficit visual que se desarrolló después de la lesión. Para determinar las consecuencias de la lesión histológica LFP, el tejido se fijaron por perfusión intracardíaca en NaCl al 0,9% seguido de paraformaldehído al 4% en los puntos de tiempo deseado después de una lesión. El tejido se postfixed la noche a 4 ° C y luego crioprotegieron en el 10% y 30% de solución de sacarosa y la inclusión. Congelados secciones seriadas se redujeron en un criostato y procesados ​​utilizando diversas técnicas immuohistochemical e histológicos. 4. Los resultados representativos: El daño inducido por el dispositivo LFP es reproducible de animal a animal, especialmente en el entrenamiento quirúrgico suficiente. Para mantener la consistencia de la lesión, la cantidad de presión suministrada a la duramadre por el dispositivo se controla. El péndulo golpea a un cilindro lleno de agua de acrílico de alta presión de la tubería y el accesorio Luer-lok que está conectado con el centro de una lesión colocada en el sitio de craniectomía en el animal (Figura 1). Por una lesión de leve a moderada, el ángulo del péndulo se fija para generar una presión que van desde 0,9 hasta 2,1 atm y un osciloscopio conectado a un amplificador se utiliza para visualizar la presión del pulso (fig. 1B). Lesión produce una gama de enderezamiento reflejo de los tiempos y un aumento de la mortalidad asociada con edema pulmonar. Lesión leve se considera un tiempo de los reflejos de 2 a 4 min y un 0 – 5% de tasa de mortalidad. Lesiones leves o moderadas se considera un momento reflejo de enderezamiento de 6 – 10 minutos y un 10 – 20% de tasa de mortalidad. Además, los ratones sometidos a LFP pueden exhibir posturas tónicas que pueden ser indicativos de la crisis. Convulsiones a menudo se asocia con una comprometida dura. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la lesión está causando daño neurológico. Animales Sham se conectan al dispositivo LFP, pero el péndulo no se libera. Para visualizar el daño inducido por la LFP, se han realizado inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos que reconocen los astrocitos y macrófagos ambos tipos de células asociadas a una respuesta a la lesión. Proteína ácida glial fibrilar (GFAP) tinción revela aumento de gliosis en la corteza en la región de la lesión whereas ratones farsa no se muestran astrocitosis aumentado en el sitio equivalente por debajo de la craniectomía (Figura 2A, B). Del mismo modo, MAC1 tinción demuestra más macrófagos que rodean el sitio de la lesión en comparación con los ratones sometidos a cirugía simulada. Además, hay un daño físico a menudo el tejido cortical visible en ratones sometidos a LFP, pero no en el simulacro los ratones (Figura 2 C, D). Las pruebas de comportamiento siguientes LFP leves se pueden utilizar para evaluar tanto los resultados cognitivos y motores. MWM se utiliza para determinar los efectos sobre el aprendizaje y la memoria. Utilizando señales visuales en la sala de pruebas, los ratones se convirtió rápidamente en farsa más eficientes en la localización de la plataforma con cada día siguientes de formación en el laberinto de agua. Ratones sometidos a LFP leves tardan más en encontrar la plataforma oculta en los primeros dos días de pruebas en relación con los ratones farsa pero parecen aprender la tarea en el tercer día (Figura 3). Estos hallazgos sugieren que la lesión se reduce la velocidad a la que los ratones pueden adquirir el aprendizaje espacial. Para determinar el efecto de una lesión en la retención de la memoria, un ensayo de investigación se lleva a cabo un día después de la última sesión de entrenamiento. Sham ratones pasan más tiempo en el cuadrante objetivo en comparación con los ratones sometidos a LFP leve lo que sugiere que la lesión ha afectado la capacidad de los ratones para recordar la ubicación de la plataforma, donde solía residir (Figura 3B). Para evaluar la función del aparato locomotor, los ratones se ponen a prueba en el dispositivo rotarod. Ratones sometidos a LFP leve tienen menor latencia media a caer en comparación con los ratones en una farsa, 7 y 21 días después de la lesión (dpi) (Figura 3C). Estos datos sugieren que los ratones lesionados han deteriorado vestibulomotor integrado y funciones sensoriales y motrices. Figura 1. LFP dispositivo y un representante de la traza del osciloscopio obtenidos durante la lesión. A) Los componentes del dispositivo LFP son: el péndulo fijo a un soporte y en un ángulo determinado para entregar la fuerza deseada, un cilindro de acrílico llena de agua con alta presión de la tubería y un macho Luer-Lok de puesto, un amplificador, y un osciloscopio. B) Representante rastro de la presión de pulso de un osciloscopio. El valor de pico a pico de 2,16 voltios que indica una presión de 1,47 atm. Figura 2. Gliosis mejorada y una respuesta inflamatoria siguientes LFP demuestra la extensión de la lesión. Congelados secciones transversales (20μm) a través del cerebro de un ratón sometido a una cirugía simulada (A, C) o una lesión LFP (B, D) 7 días después de la lesión (dpi). Imágenes corticales se toman en el epicentro de la craniectomía. (A, B) Los tejidos son teñidos con un anticuerpo para identificar los astrocitos. Proteína ácida glial fibrilar (GFAP) de anticuerpos (MAB360, Chemicon, 1:400) revela un mayor número de astrocitos en la corteza del ratón sometido a una lesión LFP (flechas) en comparación con la cirugía simulada. Secundaria de anticuerpos es de cabra anti-ratón de 594 (1:1000). (C, D) Los tejidos son teñidos con un anticuerpo para identificar a los macrófagos. MAC1 anticuerpos (MAC1-alfa de la cadena CD11b, BD Biosciences, 1:50) revela más macrophges y / o la microglía activada en todo el sitio de la lesión en la corteza (flechas) en comparación con la cirugía simulada. Anticuerpo secundario es la rata de cabra anti CY3 (1:50). Barra de escala = 200μm en A y B, 100μm en C y D. Figura 3. Pruebas de comportamiento siguientes LFP leve demuestra déficit en comparación con los ratones lesionados farsa. A) Los ratones sometidos a LFP leves tardan más en aprender la tarea de encontrar la plataforma en la que los ratones MWM farsa. Sham vs LFP (segundo ave ± SEM) 1 día 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63; 2 días 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11; 3 días 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 farsa, 10 LFP) . B) Los ratones sometidos a LFP leves pasan menos tiempo en el cuadrante de destino durante el juicio de la sonda de 24 horas después del último entrenamiento en la relación con los ratones MWM farsa (21 dpi, n = 10). C) Los ratones sometidos a LFP leve caer fuera del dispositivo rotarod antes que los ratones farsa (1, 7 y 21 dpi, n = 5 farsa, 8 LFP). Las barras de error representan SE.