Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis</em
Summary
Kurbağa<em> Xenopus laevis</em> Antijen-spesifik CD8 T hücre yanıtları teşvik etmek gibi gp96 ısı şoku proteini yeteneği keşfetmek için cazip bir alternatif olmayan memeli modeli sağlar. Biz yöntemleri eğitim sunmak<em> In vivo</em> Gp96 tarafından cilt ve tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırma.
Abstract
Amfibi Xenopus geliştirilen chaperoned antijenlerin çapraz sunum kolaylaştırmak ve doğal ve adaptif T hücre tepkiler. Xenopus deri grefti reddi gibi gp96 olarak belirli bir ısı şok proteinleri (HSP) yeteneği çalışma olmayan eşsiz bir memeli modeli laevis klasik MHC sınıf Ia (sınıf Ia) kısıtlı T hücre yanıtlarını ortaya çıkarmak için gp96 yeteneğini araştırmak için mükemmel bir platform sağlar. Ayrıca, Xenopus model sistem, böylece bağışıklık gözetim kaçan kendi sınıf Ia molekülleri aşağı düzenlenmiş tümörlere karşı tepkiler oluşturmak için gp96 yeteneği keşfetmek için farelere de cazip bir alternatif sağlar . Son zamanlarda, peritoneal lökosit antijen sunan hücreler (APC) olarak kullanarak Xenopus klonları bir evlatlık hücre transferi tahlil ve gösterdi ki küçük histokompatibilite cilt antijenlere karşı yanı sıra, Xenopus timik tümör 15 karşı in vivo gp96. Başbakan CD8 T hücre yanıtlarını sınıf Ia molekülleri ifade etmez / 0. Burada periton lökositlerin ortaya çıkarma, attığı evlatlık transferi, yanı sıra deri grefti ve tümör nakli deneyleri dahil olmak üzere bu testleri gerçekleştirmek için ilgili metodoloji açıklanmaktadır. Ayrıca biz de, periferik kan lökositleri akım sitometri ve cilt ret ve anti-tümör cevapların yer efektör nüfus daha fazla karakterizasyonu için izin proliferasyon deneyleri için kullanılan toplama ve ayırma nitelendiriyor.
Protocol
Discussion
Amfibi Xenopus bağışıklık çalışmak için benzersiz çok yönlü olmayan memeli modeli. Biyomedikal ve immünolojik araştırmalar yaygın kullanımı MHC tanımlanan klonlar LG-6 ve LG-15 gibi farklı hücre hatları ve monoklonal antikorlar gibi birçok önemli araştırma araçları vermiştir. Güçlü Ag-özel, küçük bir anti-H-Ag ve anti-tümör T hücre yanıtları 7 arabuluculuk gibi gp96 ısı şok proteinleri yeteneği çalışma in vitro ve in vivo deneylerde farklı kur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tina Martin ve David Albright tarafından sağlanan uzman hayvancılık minnetle takdir edilmektedir. Bu araştırma, NIH hibe T32-AI-07.285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCK), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059.830-06 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
