مقارن في الجسم الحي دراسة gp96 Adjuvanticity في الضفدع القيطم المورق</em
Summary
الضفدع<em> القيطم المورق</em> يوفر بديلا جذابا غير الثدييات نموذج لاستكشاف قدرة بروتين الصدمة الحرارية مثل gp96 لتعزيز محددة مستضد الخلايا التائية CD8 الردود. نقدم لدراسة أساليب<em> في الجسم الحي</em> تسهيل التقديم عبر المستضدات الجلد والورم عن طريق gp96.
Abstract
وضعنا في القيطم البرمائيات المورق فريدة غير الثدييات نموذج لدراسة قدرة بعض بروتينات الصدمة الحرارية (hsps) مثل gp96 لتسهيل عبر تقديم المستضدات فقدوا ذويهم والحصول على فطرية وقابلة للتكيف استجابات الخلايا التائية. طعم الجلد القيطم الرفض يوفر منبرا ممتازا لدراسة قدرة gp96 لانتزاع الطبقة الأولى أ MHC الكلاسيكية (الدرجة الأولى أ) تقتصر ردود الخلايا التائية. بالإضافة إلى ذلك ، في النظام النموذجي القيطم كما يوفر بديلا جذابا لالفئران لاستكشاف قدرة على توليد استجابات gp96 ضد الأورام التي ينظم بها أسفل الدرجة الأولى أ جزيئات الهروب بالتالي مراقبة المناعي. في الآونة الأخيرة ، وقد وضعنا عملية نقل الخلايا في استنساخ بالتبني مقايسة القيطم باستخدام خلايا الكريات البيض البريتوني وتقديم المستضد (ناقلات الجنود المدرعة) ، وأظهرت أن رئيس الوزراء يمكن gp96 الخلايا التائية CD8 الردود في التعديلات المجراة ضد مستضدات التوافق النسيجي الجلد وكذلك ضد الورم التوتة القيطم 15 / 0 الذي لا يعبر عن الطبقة الأولى أ الجزيئات. نحن هنا وصف المنهجية المعنية لتنفيذ هذه المقايسات بما في ذلك نقل الاستنباط ، ويتقطع بالتبني من الكريات البيض البريتوني ، فضلا عن طعم الجلد والمقايسات زرع الورم. بالإضافة إلى ذلك نحن تصف أيضا الحصاد وفصل الكريات البيض في الدم الطرفية المستخدمة في التدفق الخلوي والمقايسات الانتشار التي تسمح لتوصيف مزيد من السكان المستجيب رفض المشاركة في الجلد والردود المضادة للورم.
Protocol
Discussion
والقيطم البرمائيات هي فريدة من نوعها تنوعا غير الثدييات نموذج لدراسة الحصانة. وقد أسفر استخدام واسعة النطاق في مجال الأبحاث الطبية البيولوجية والمناعية في العديد من الأدوات البحثية الهامة مثل استنساخ MHC تعريف LG – 6 و LG – 15 فضلا عن خطوط مختلفة من الخلايا والأجسام ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويقدر بامتنان تربية الحيوانات الخبراء التي يقدمها مارتن تينا وديفيد اولبرايت. وأيد هذا البحث عن طريق المنح T32 – AI – 07285 (HN) ، NIH R25 2GM064133 (TCL) ، 1R03 – HD061671 – 01 ، R24 – AI – 059830-06 من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
