Comparative In vivo Etude de gp96 adjuvanticité de la grenouille Xenopus laevis</em
Summary
La grenouille<em> Xenopus laevis</em> Fournit une intéressante alternative non-mammifère modèle pour explorer la capacité de la protéine de choc thermique tels que gp96 à promouvoir spécifiques de l'antigène des cellules T CD8. Nous présentons des méthodes pour étudier<em> In vivo</emFacilitation> des présentation croisée d'antigènes tumoraux par la peau et gp96.
Abstract
Nous avons développé dans le Xenopus laevis amphibiens unique non mammifères modèle pour étudier la capacité de certaines protéines de choc thermique (HSP), tels que gp96 pour faciliter la présentation croisée des antigènes chaperonné et susciter innée et adaptative réponses des lymphocytes T. Rejet de greffe de peau de Xenopus fournit une excellente plateforme pour étudier la capacité de gp96 à susciter classiques du CMH de classe Ia (classe Ia) restreint les réponses des cellules T. De plus, le système modèle Xénope fournit également une alternative intéressante à la souris pour explorer la capacité de gp96 à générer des réponses contre les tumeurs qui ont régulé à la baisse de leurs molécules de classe Ia échappant ainsi à la surveillance immunitaire. Récemment, nous avons développé une méthode de criblage cellulaire adoptive de transfert en utilisant des clones de Xenopus leucocytes péritonéale comme des cellules présentatrices d'antigène (CPA), et montré que gp96 peut Premier réponses des lymphocytes T CD8 in vivo contre des antigènes mineurs d'histocompatibilité de peau ainsi que contre la tumeur du thymus Xenopus 15 / 0 qui n'exprime pas les molécules Ia classe. Nous décrivons ici la méthodologie utilisée pour effectuer ces tests, y compris le transfert d'élicitation, pulsant et adoptive de leucocytes péritonéale, ainsi que la greffe de peau et des essais de transplantation de tumeurs. De plus nous sommes également décrit la récolte et la séparation des leucocytes du sang périphérique utilisé pour la cytométrie de flux et de tests de prolifération qui permettent une caractérisation plus poussée des populations effectrices impliquées dans le rejet de la peau et des réponses antitumorales.
Protocol
Discussion
Les amphibiens Xenopus est unique polyvalent non mammifères modèle pour étudier l'immunité. Son utilisation intensive dans la recherche biomédicale et immunologiques a donné de nombreux outils de recherche importants tels que les clones CMH définies LG et LG-6-15 ainsi que différentes lignées de cellules et d'anticorps monoclonaux. Grâce à ces outils, nous avons établi différentes in vitro et in vivo pour étudier la capacité des protéines de choc thermique tels que gp96…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'élevage d'experts fournis par Tina Martin et David Albright est grandement apprécié. Cette recherche a été financée par des subventions T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 du NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
