ゴナドマイクロインジェクション:C.エレガンスの生殖細胞に直接化合物送達する方法
Published: April 30, 2023
Abstract
出典:ファルボウド 、B.ら、 多様な細胞および生物におけるCas9リボヌクレオタンパク質による強化されたゲノム編集。 J. ヴィス・エクス (2018).
このビデオでは、トランスジェニック C.エレガン 株を作成する一般的な方法であるマイクロインジェクションについて説明します。 例では、CRISPR塩基遺伝子編集用のリボヌクレオプロテイン(RNP)複合体を導入するために使用されるマイクロインジェクションが見られます。
Protocol
以下のプロトコルは、Farboudらからの抜粋であり、多様な細胞および生物におけるCas9リボヌクレオタンパク質による強化されたゲノム編集、J.Vis. Exp. (2018) 1. RNP アセンブリ 事前に実験を設計し、すべてのRNA、DNA、タンパク質成分を事前に取得しま?…
Representative Results
表1:ゲノム編集実験の予備のためのポジティブコントロールこの表は、このプロトコルで説明されている各細胞および生物において、初めてゲノム編集実験を行うために必要な重要な情報を示しています。これらのパラメータに従うと、実験者が自分の関心のある遺伝子を標的にした後、プロトコルをテス…
Materials
| Reagents/Materials | |||
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
| Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
| Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
| Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
| Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
| 9" pasteur pipettes | – | ||
| Nuclease-free water | – | ||
| Equipment | |||
| MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
| Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
| Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
| Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
| Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
Cite This Article
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).