Cette vidéo décrit la microinjection, une méthode courante de création de souches transgéniques de C. elegans. Dans l’exemple, nous verrons la microinjection utilisée pour introduire un complexe de ribonucléoprotéines (RNP) pour l’édition des gènes CRISPR-bases.
Protocol
Le protocole suivant est un extrait de Farboud et coll., Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018). 1. Assemblée RNP Concevez l’expérience bien à l’avance, en acquérant à l’avance tous les composants arn, ADN et protéines. Dans un premier temps, essayez l?…
Representative Results
Tableau 1 : Contrôles positifs pour les expériences préliminaires d’édition du génome. Ce tableau montre les informations clés nécessaires pour effectuer une première expérience d’édition du génome dans chacune des cellules et organismes décrits dans ce protocole. Suivre ces paramètres est susceptible de donner un résultat réussi qui peut être utilisé pour tester le protocole ou comme …
Materials
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
–
IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs
Synthego
–
Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)
New England Biosciences
M0646T
If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli
Caenorhabditis Genetics Center
OP-50
https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes
–
–
See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID
World Precision Instruments
1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID
World Precision Instruments
1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm
Thermo Fisher Scientific
12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm
Thermo Fisher Scientific
12-518-105K
Apex LE agarose
Genesee Scientific
20-102
Halocarbon oil 700
Sigma-Aldrich
H8898-100ML
pCFJ90 plasmid
Addgene
19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)
World Precision Instruments
T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)
–
9" pasteur pipettes
–
Nuclease-free water
–
Equipment
MZ75 Stereomicroscope
Leica
Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope