Fast Protein Liquid Chromatographyシステムを用いた6X-Hisタグ付きタンパク質のアフィニティー精製(英語)

細胞生物学を理解するためには、数多くの戦略が考えられます。1つのアプローチには、遺伝子変異を遺伝子に導入し、その後、モデル生物に結果として生じる表現型の変化を評価するトップダウン戦略が含まれます。逆に、還元主義的アプローチでは、特定のタンパク質の分子メカニズムと酵素機能の最初の解明を伴い、他の細胞成分との相互作用の特性評価を伴います。その後、このタンパク質が生物学的経路に与える影響が評価されます。それぞれの研究アプローチには固有の利点と限界がありますが、生物学的経路を包括的に理解するには、学際的な研究が必要です。

DNAは生命の遺伝的設計図であり、DNA複製とゲノム維持のメカニズムを理解することは、70年以上にわたって活発な関心が寄せられてきた分野です。DNA複製の分野における研究は、多数の複製タンパク質の個々の構造と機能に関する豊富なデータを生み出しています。これらの調査は、機構的側面と生化学的活性アッセイを包含しており、これらのタンパク質の精製を通じて実現可能になり、 in vitro 環境での綿密な検査が可能になりました。その結果、タンパク質の精製は、DNA複製のメカニズムの洞察を解明することを目的とした研究の大部分において、不可欠でユビキタスな技術として浮上しています。

この記事では、細菌細胞で過剰発現している6X-ヒスチジンでタグ付けされたDNA複製タンパク質を単離する方法を紹介します。関心のあるタンパク質は、ヒト皮弁エンドヌクレアーゼ1(FEN1)であり、これは構造特異的なヌクレアーゼであり、遅延する鎖複製において極めて重要な役割を果たし、塩基切除修復(BER)^1,2,3のようなDNA修復経路にも重要な関与しています。FEN1の主な機能は、DNA複製またはBER中に生じる中間体である5’変位フラップ構造の基部で切断することです。当初、FEN1の酵素活性を評価する生化学的研究は、ヌクレアーゼがフラップ構造の遊離5′-リン酸末端を認識し、フラップに沿ってその基部まで追跡してから切断する「トラッキング」メカニズムを示唆^した4。その後の研究により、FEN1は、最初にフラップの基部に結合し、次に切断前にその活性部位に遊離5’末端を通す「スレッディング」メカニズムを介して動作することが明らかになりました(図1)⁵。組換えFEN1を過剰発現して単離する能力は、これらのブレークスルーを促進し、研究者が生化学的および構造的研究にFEN1を使用することを可能にしました。

アフィニティークロマトグラフィーは、DNAを精製するために一般的に使用される分離法です。この技術は、標的タンパク質が樹脂に固定化されたリガンドに対して可逆的に結合する親和性を利用して、目的のタンパク質を特異的にトラップします。最も広く使用されているバイオアフィニティーの1つは、アミノ酸、ヒスチジン、およびニッケルやコバルトなどの金属イオンとの間の強固な相互作用であり、したがって、Ni²⁺ またはCo²⁺を充填した樹脂に捕捉できます。

6-9ヒスチジン残基(His)のストリングをコードするDNA配列は、目的タンパク質(N末端またはC末端)をコードするプラスミドコンストラクトに頻繁に組み込まれ、タンパク質に6X-Hisタグまたはポリ-Hisタグをタグ付けします。その後、Hisタグ付きタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーのサブタイプである固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって容易に精製でき、これにより、樹脂上の金属イオンがアフィニティータグを持つタンパク質を捕捉し、後で適切な溶出剤を使用して溶出することができます。Ni²⁺ やCo²⁺ などの遷移金属イオンは 、N,N,N’-トリス-(カルボキシメチル)-エチレンジアミンまたはニトリロトリアセチン(NTA^)基6に由来するアガロースまたはシリカゲルマトリックスに固定化できます。

金属配位子は、物理的、化学的、および生物学的要因による分解に対して堅牢であることが知られており、この利点を他のタイプの配位子^6,7よりも保持しています。さらに、Hisタグは比較的小さなタグであり、タンパク質の構造や機能に大きな影響を与えません⁷。しかし、細菌発現系では、染色体で発現した多くのタンパク質が金属イオンに対して親和性を持ち、標的タンパク質と共精製することがあります。ニッケルとコバルトは、IMACマトリックスで使用される典型的な金属イオンです。Ni-NTA樹脂とTALONコバルトベース樹脂は、Hisタグ付きタンパク質の精製に一般的に使用されます。

Ni-NTAとTALONの比較
Ni-NTAとTALONのそれぞれの金属イオンは、NTA配位子を介して樹脂に固定化されます。Ni-NTAは、最大100 mg / mLのタンパク質に結合する、より高い結合能を持つと考えられています。これにより、タンパク質の収量が増加する可能性がありますが、汚染物質のタンパク質が共精製される可能性があるという注意点があります。対照的に、この樹脂はHisタグ付きタンパク質に対してより高い結合特異性を有し、より高純度の画分を産生することができる可能性がある。この研究では、参照されている自動高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムであるNGCシステムを使用して、両方の樹脂の精製効率を比較することを目指しています( 材料表を参照)。

バッファと互換性
バッファーは、細胞溶解、サンプル調製、樹脂平衡化、および樹脂から捕捉されたタンパク質の溶出のために、タンパク質精製中に必要です。100 mMまでのTris、MOPS、およびHEPESバッファーは、Ni-NTA樹脂に適合することが知られています。バッファーには、タンパク質の酸化やタンパク質凝集を防ぐための還元剤が含まれていることがよくあります。ただし、しきい値を超えると、還元剤は樹脂から金属イオンを剥がす可能性があります。β-メルカプトエタノール(BME)やジチオスレイトール(DTT)などの還元剤の推奨濃度は、上記のニッケルおよびコバルトベースの樹脂で1 mM未満です。

hFEN1の精製用バッファーは、NaCl、BME、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、EDTA、およびグリセロールを含むTrisバッファーです。NaClはタンパク質を可溶性の形で保持し、DNA結合などの分子相互作用を破壊します。BMEは酸化タンパク質を減少させ、それによってタンパク質の凝集を防ぎます。PMSF)は、プロテアーゼを介した標的タンパク質の分解を防ぐプロテアーゼ阻害剤です。EDTAは、サンプルから二価カチオンを排除し、ヌクレアーゼやプロテアーゼへのアクセスを防ぎます。グリセロールは、水性タンパク質の安定性を高めます。さらに、溶解バッファーには完全なプロテアーゼ阻害剤錠剤が含まれており、細胞溶解中の分解プロテアーゼから標的タンパク質を最大限に保護します。平衡化バッファーと溶出バッファーにはイミダゾールが含まれており、溶出バッファーには、溶出中に結合タンパク質を樹脂から置換するためのイミダゾールが大量に含まれています。

次世代クロマトグラフィー(NGC)システム
この自動化された中圧クロマトグラフィーシステムは、高速フロータンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)用に設計されたもので、2つのポンプを使用して2つの異なるバッファーを同時にポンピングし、250 μLから100 mLまでの幅広いサンプル量を注入できます。サンプルループ(このシステムではDynaloopと呼ばれます)により、より多くのサンプルを注入することができます。このシステムは、カスタマイズされたメソッドの作成、精製ランの操作、UVピークとタンパク質画分の分析を容易にするChromlabソフトウェアを使用して操作できます。