טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

קיימות אסטרטגיות רבות להבנת הביולוגיה התאית. גישה אחת כוללת אסטרטגיה מלמעלה למטה, שבה מוטציות גנטיות מוכנסות לתוך גן, ואחריו הערכה של שינויים פנוטיפיים כתוצאה מכך אורגניזם מודל. לעומת זאת, גישה רדוקציוניסטית כרוכה בהבהרה ראשונית של מנגנונים מולקולריים ופונקציות אנזימטיות של חלבון מסוים, המלווה באפיון יחסי הגומלין שלו עם רכיבים תאיים אחרים. לאחר מכן, ההשפעה של חלבון זה על מסלול ביולוגי מוערך. למרות שלכל גישה מחקרית יתרונות ומגבלות מובנים, השגת הבנה מקיפה של מסלול ביולוגי מחייבת חקירות בין-תחומיות.

מכיוון שהדנ”א הוא התוכנית הגנטית של החיים, הבנת מנגנוני שכפול הדנ”א ותחזוקת הגנום היא תחום עניין פעיל כבר למעלה משבעה עשורים. מחקרים בתחום שכפול הדנ”א הניבו נתונים רבים לגבי המבנים והתפקודים הבודדים של חלבוני שכפול רבים. בירורים אלה, הכוללים היבטים מכניסטיים ומבחני פעילות ביוכימית, נעשו אפשריים באמצעות טיהור חלבונים אלה, המאפשרים את בחינתם המדוקדקת בסביבה חוץ-גופית . כתוצאה מכך, טיהור חלבונים מתגלה כטכניקה הכרחית ונפוצה ברוב מאמצי המחקר המיועדים לפענוח תובנות מכניסטיות לגבי שכפול DNA.

מאמר זה מציג מתודולוגיה לבידוד חלבון שכפול DNA המתויג עם 6X-היסטידין, אשר בא לידי ביטוי יתר בתאי חיידקים. החלבון המעניין הוא אנדונוקלאז דש אנושי 1 (FEN1), נוקלאז ספציפי למבנה הממלא תפקיד מרכזי בשכפול גדילים מפגרים והוא גם משתתף קריטי במסלולי תיקון DNA כמו תיקון כריתת בסיס (BER)^1,2,3. תפקידו העיקרי של FEN1 הוא להיבקע בבסיס מבנה דש שנעקר מ-5 אינץ’, חומר ביניים שנוצר במהלך שכפול DNA או BER. בתחילה, מחקרים ביוכימיים שהעריכו את הפעילות האנזימטית של FEN1 הציעו מנגנון “מעקב”, שבו הנוקלאז יזהה את הקצה החופשי של 5′-פוספט של מבנה הדש ולאחר מכן יעקוב לאורך הדש לבסיסו לפני שיבקע אותו⁴. מחקר מאוחר יותר גילה כי FEN1 פועל באמצעות מנגנון “השחלה”, שבו הוא נקשר תחילה לבסיס הדש ולאחר מכן משחיל את קצה 5′ החופשי דרך האתר הפעיל שלו לפני המחשוף (איור 1)⁵. היכולת לבטא יתר על המידה ולבודד FEN1 רקומביננטי אפשרה פריצות דרך אלה, ואפשרה לחוקרים להשתמש בו בחקירות ביוכימיות ומבניות.

כרומטוגרפיית זיקה היא שיטת הפרדה נפוצה לטיהור DNA. טכניקה זו משתמשת בזיקה ההפיכה של חלבוני מטרה כלפי ליגנדות המשותקות על שרף כדי ללכוד באופן ספציפי את החלבון המעניין. אחת הזיקות הביולוגיות הנפוצות ביותר היא האינטראקציה החזקה בין חומצת האמינו, היסטידין ויוני מתכת כגון ניקל וקובלט ולכן ניתן ללכוד אותם על גבי שרף הטעון ב- Ni²⁺ או Co²⁺.

רצף הדנ”א המקודד מחרוזת של 6-9 שאריות היסטידין (His) משולב לעתים קרובות במבנה הפלסמיד המקודד את החלבון המעניין (ב-N-terminus או ב-C-terminus), ומתייג את החלבון בתג 6X-His-tag או בתג poly-His. לאחר מכן ניתן לטהר בקלות את החלבון המתויג שלו על ידי כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת (IMAC), תת-סוג של כרומטוגרפיית זיקה שבה יוני מתכת על השרף לוכדים חלבונים עם תג זיקה, אשר מאוחר יותר ניתן לדלל באמצעות סוכני אלוציה מתאימים. יוני מתכת מעבר כגון Ni²⁺ ו- Co²⁺ יכולים להיות משותקים על מטריצות אגרוז או סיליקה ג’ל שמקורן בקבוצות N,N,N’-tris-(carboxymethyl)-ethylenediamine או nitrilotriacetic acid (NTA)⁶.

ליגנדות מתכת ידועות כעמידות בפני התפרקות על ידי גורמים פיזיקליים, כימיים וביולוגיים ומחזיקות ביתרון זה על פני סוגים אחרים של ליגנדות ^6,7. בנוסף, התג His-tag הוא תג קטן יחסית ואינו משפיע באופן משמעותי על מבנה החלבון או תפקוד⁷. עם זאת, במערכת ביטוי חיידקית, חלבונים רבים המבוטאים כרומוזומלית הם בעלי זיקה כלפי יוני מתכת ועשויים לטהר יחד עם חלבון המטרה. ניקל וקובלט הם יוני המתכת האופייניים המשמשים במטריצות IMAC. שרף Ni-NTA ושרף קובלט TALON משמשים בדרך כלל לטיהור חלבונים המסומנים על ידי His.

ני-נת”ע מול טאלון
יוני המתכת בהתאמה של Ni-NTA ו- TALON משותקים על השרף באמצעות ליגנדות NTA. Ni-NTA נחשב כבעל יכולת קשירה גבוהה יותר, הקושרת עד 100 מ”ג/מ”ל חלבון. זה יכול לגרום לתפוקת חלבון גבוהה יותר, עם אזהרה כי חלבונים מזהמים עשויים להיות מטוהרים במשותף. לעומת זאת, לשרף יש סגוליות קשירה גבוהה יותר כלפי חלבונים מתויגים וייתכן שהוא מסוגל לייצר שברים של טוהר גבוה יותר. במחקר זה, אנו שואפים להשוות את יעילות הטיהור של שני השרפים באמצעות מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית האוטומטית של חלבון מהיר, מערכת NGC (ראה טבלת חומרים).

מאגרים ותאימות
חוצצים נדרשים במהלך טיהור חלבון עבור ליזה של תאים, הכנת דגימה, שיווי משקל שרף, ו eluti של החלבון שנלכד מן השרף. מאגרי Tris, MOPS ו-HEPES עד לריכוז של 100 מילימטר הם המאגרים התואמים הידועים לשרף Ni-NTA. מאגרים כוללים לעתים קרובות חומרים מחזרים כדי למנוע חמצון של חלבון וצבירת חלבונים. עם זאת, מעל גבול הסף, חומרים מחזרים יכולים להפשיט את השרף של יוני מתכת. הריכוז המומלץ של חומרים מחזרים כגון בטא-מרקפטואתנול (BME) או דיתיותרייטול (DTT) הוא מתחת ל-1 מילימול עבור השרפים מבוססי הניקל והקובלט שהוזכרו לעיל.

המאגרים לטיהור hFEN1 הם מאגרי Tris המכילים NaCl, BME, פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF), EDTA וגליצרול. NaCl שומר על החלבון בצורה מסיסה ומשבש אינטראקציות מולקולריות כגון קשירת DNA. BME מפחית חלבונים מחומצנים ובכך מונע צבירת חלבונים. PMSF) הוא מעכב פרוטאז המונע פירוק בתיווך פרוטאז של חלבון המטרה. EDTA מבטל קטיונים דו-ערכיים מהדגימה, ומונע את גישתם לנוקלאזות ולפרוטאזות. גליצרול משפר את יציבות החלבון בצורה מימית. בנוסף, מאגר הליזה מכיל טבליות מעכבות פרוטאז מלאות כדי להבטיח הגנה מרבית של חלבון המטרה מפני פירוק פרוטאזות במהלך ליזה של התא. מאגרי שיווי המשקל והאלוציה מכילים אימידזול, כאשר מאגר האלוטיון מכיל כמויות גבוהות יותר עבור האימידזול כדי להזיז את החלבון הקשור מהשרף במהלך ההדבקה.

מערכת כרומטוגרפיה מהדור הבא (NGC)
מערכת כרומטוגרפיה אוטומטית זו בלחץ בינוני המיועדת לכרומטוגרפיה נוזלית של חלבונים בזרימה מהירה (FPLC) משתמשת בשתי משאבות כדי לשאוב בו זמנית שני מאגרים שונים ומסוגלת להזריק מגוון רחב של נפחי דגימה מ-250 מיקרוליטר עד 100 מ”ל. לולאת הדגימה (המכונה Dynaloop במערכת זו), מאפשרת להזריק נפחי דגימה גדולים יותר. ניתן להפעיל את המערכת באמצעות תוכנת Chromlab, המאפשרת יצירת שיטות מותאמות אישית, מניפולציה של ריצות טיהור וניתוח פסגות UV ושברים חלבוניים.