Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System

Für das Verständnis der Zellbiologie stehen zahlreiche Strategien zur Verfügung. Ein Ansatz beinhaltet eine Top-down-Strategie, bei der genetische Mutationen in ein Gen eingebracht werden, gefolgt von der Bewertung der daraus resultierenden phänotypischen Veränderungen in einem Modellorganismus. Umgekehrt beinhaltet ein reduktionistischer Ansatz die anfängliche Aufklärung der molekularen Mechanismen und enzymatischen Funktionen eines bestimmten Proteins, begleitet von der Charakterisierung seiner Wechselwirkungen mit anderen zellulären Komponenten. Anschließend wird der Einfluss dieses Proteins auf einen biologischen Signalweg bewertet. Obwohl jeder Forschungsansatz seine inhärenten Vorteile und Grenzen hat, erfordert ein umfassendes Verständnis eines biologischen Signalwegs interdisziplinäre Untersuchungen.

Da die DNA der genetische Bauplan des Lebens ist, ist das Verständnis der Mechanismen der DNA-Duplikation und der Genomerhaltung seit über sieben Jahrzehnten ein Bereich von aktivem Interesse. Untersuchungen auf dem Gebiet der DNA-Replikation haben umfangreiche Daten über die individuellen Strukturen und Funktionen zahlreicher Replikationsproteine erbracht. Diese Untersuchungen, die mechanistische Aspekte und biochemische Aktivitätstests umfassen, wurden durch die Aufreinigung dieser Proteine ermöglicht, die eine sorgfältige Untersuchung in einem In-vitro-Milieu ermöglicht. Folglich erweist sich die Proteinreinigung als unverzichtbare und allgegenwärtige Technik in den meisten Forschungsbemühungen, die darauf abzielen, mechanistische Erkenntnisse über die DNA-Replikation zu entschlüsseln.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung eines DNA-Replikationsproteins vorgestellt, das mit 6X-Histidin markiert ist und in Bakterienzellen überexprimiert wurde. Das Protein von Interesse ist die humane Lappen-Endonuklease 1 (FEN1), eine strukturspezifische Nuklease, die eine zentrale Rolle bei der verzögerten Strangreplikation spielt und auch eine wichtige Rolle bei DNA-Reparaturwegen wie der Basenexzisionsreparatur (BER) ^spielt1,2,3. Die Hauptfunktion von FEN1 besteht darin, an der Basis einer 5′-verschobenen Lappenstruktur zu spalten, ein Zwischenprodukt, das während der DNA-Replikation oder BER entsteht. Ursprünglich deuteten biochemische Untersuchungen zur Bewertung der enzymatischen Aktivität von FEN1 auf einen “Tracking”-Mechanismus hin, bei dem die Nuklease das freie 5′-Phosphat-Ende einer Lappenstruktur erkennt und dann entlang des Lappens bis zu seiner Basis folgt, bevor sie es^{spaltet 4}. Spätere Untersuchungen ergaben, dass FEN1 über einen “Einfädel”-Mechanismus arbeitet, bei dem es zuerst an die Basis des Lappens bindet und dann das freie 5′-Ende vor der Spaltung durch sein aktives Zentrum fädelt (Abbildung 1)⁵. Die Fähigkeit, rekombinantes FEN1 zu überexprimieren und zu isolieren, hat diese Durchbrüche ermöglicht und ermöglicht es Forschern, es in biochemischen und strukturellen Untersuchungen einzusetzen.

Die Affinitätschromatographie ist eine häufig verwendete Trennmethode zur Aufreinigung von DNA. Diese Technik nutzt die reversible Bindungsaffinität von Zielproteinen zu Liganden, die auf einem Harz immobilisiert sind, um das gewünschte Protein spezifisch einzufangen. Eine der am weitesten verbreiteten Bioaffinitäten ist die robuste Wechselwirkung zwischen der Aminosäure Histidin und Metallionen wie Nickel und Kobalt und kann daher auf einem mit Ni²⁺ oder Co²⁺ geladenen Harz eingefangen werden.

Die DNA-Sequenz, die für eine Kette von 6-9 Histidresten (His) kodiert, wird häufig in das Plasmidkonstrukt eingebaut, das das Protein von Interesse kodiert (entweder am N-Terminus oder am C-Terminus), wodurch das Protein mit einem 6X-His-Tag oder einem Poly-His-Tag markiert wird. Das His-markierte Protein kann dann leicht durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) aufgereinigt werden, eine Unterart der Affinitätschromatographie, bei der Metallionen auf dem Harz Proteine mit einem Affinitätstag einfangen, die später mit geeigneten Elutionsmitteln eluiert werden können. Übergangsmetallionen wie Ni²⁺ und Co²⁺ können auf Agarose- oder Kieselgelmatrizen immobilisiert werden, die von N,N,N’-Tris-(Carboxymethyl)-ethylendiamin oder Nitrilotriacetinsäure (NTA)-Gruppen^{abgeleitet sind 6}.

Es ist bekannt, dass Metallliganden robust gegen Degradation durch physikalische, chemische und biologische Faktoren sind und diesen Vorteil gegenüber anderen Arten von Liganden haben ^6,7. Darüber hinaus ist der His-Tag ein relativ kleiner Tag und hat keinen signifikanten Einfluss auf die Proteinstruktur oder -funktion⁷. In einem bakteriellen Expressionssystem haben jedoch viele chromosomal exprimierte Proteine eine Affinität zu Metallionen und können mit dem Zielprotein co-reinigen. Nickel und Kobalt sind die typischen Metallionen, die in IMAC-Matrizen verwendet werden. Das Ni-NTA-Harz und das kobaltbasierte TALON-Harz werden häufig für die Aufreinigung von His-markierten Proteinen verwendet.

Ni-NTA gegen TALON
Die jeweiligen Metallionen sowohl von Ni-NTA als auch von TALON werden durch NTA-Liganden auf dem Harz immobilisiert. Es wird angenommen, dass Ni-NTA eine höhere Bindungskapazität hat und bis zu 100 mg/ml Protein bindet. Dies kann zu einer höheren Proteinausbeute führen, mit dem Vorbehalt, dass verunreinigte Proteine mitgereinigt werden können. Im Gegensatz dazu weist das Harz eine höhere Bindungsspezifität gegenüber His-markierten Proteinen auf und ist möglicherweise in der Lage, Fraktionen höherer Reinheit herzustellen. In dieser Studie versuchen wir, die Reinigungseffizienz beider Harze mit Hilfe des referenzierten automatisierten schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie-Systems, dem NGC-System, zu vergleichen (siehe Materialtabelle).

Puffer und Kompatibilität
Puffer werden während der Proteinaufreinigung für die Zelllyse, die Probenvorbereitung, die Harzäquilibrierung und die Elution des eingefangenen Proteins aus dem Harz benötigt. Tris-, MOPS- und HEPES-Puffer bis zu einer Konzentration von 100 mM sind die bekannten kompatiblen Puffer für das Ni-NTA-Harz. Puffer enthalten häufig Reduktionsmittel, um die Oxidation von Protein und Proteinaggregation zu verhindern. Oberhalb eines Schwellenwerts könnten Reduktionsmittel das Harz jedoch von Metallionen befreien. Die empfohlene Konzentration von Reduktionsmitteln wie Beta-Mercaptoethanol (BME) oder Dithiothreitol (DTT) liegt für die oben genannten Nickel- und Kobaltbasisharze unter 1 mM.

Die Puffer für die Aufreinigung von hFEN1 sind Tris-Puffer, die NaCl, BME, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), EDTA und Glycerin enthalten. NaCl hält das Protein in löslicher Form und stört molekulare Wechselwirkungen wie die DNA-Bindung. BME reduziert oxidierte Proteine und verhindert dadurch die Proteinaggregation. PMSF) ist ein Proteaseinhibitor, der den Protease-vermittelten Abbau des Zielproteins verhindert. EDTA eliminiert zweiwertige Kationen aus der Probe und verhindert so ihren Zugang zu Nukleasen und Proteasen. Glycerin erhöht die Stabilität des Proteins in wässriger Form. Zusätzlich enthält der Lysepuffer vollständige Proteasehemmer-Tabletten, um einen maximalen Schutz des Zielproteins vor dem Abbau von Proteasen während der Zelllyse zu gewährleisten. Die Äquilibrierungs- und Elutionspuffer enthalten Imidazol, wobei der Elutionspuffer höhere Mengen für das Imidazol enthält, um das gebundene Protein während der Elution aus dem Harz zu verdrängen.

Chromatographie-System der nächsten Generation (NGC)
Dieses automatisierte Mitteldruck-Chromatographiesystem, das für die schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) entwickelt wurde, verwendet zwei Pumpen, um gleichzeitig zwei verschiedene Puffer zu pumpen, und ist in der Lage, eine Vielzahl von Probenvolumina von 250 μl bis 100 ml zu injizieren. Die Sample-Schleife (in diesem System als Dynaloop bekannt) ermöglicht es, größere Probenvolumina zu injizieren. Das System kann mit der Chromlab-Software betrieben werden, die die Erstellung kundenspezifischer Methoden, die Manipulation von Reinigungsläufen und die Analyse von UV-Peaks und Proteinfraktionen ermöglicht.