使用 Fast Protein 液相色谱系统对 6X-His 标签蛋白进行亲和纯化

有许多策略可用于理解细胞生物学。一种方法涉及自上而下的策略，其中将基因突变引入基因，然后评估模式生物中产生的表型变化。相反，还原论方法需要初步阐明特定蛋白质的分子机制和酶功能，并同时表征其与其他细胞成分的相互作用。随后，评估这种蛋白质对生物途径的影响。尽管每种研究方法都有其固有的优势和局限性，但要全面了解生物途径需要跨学科研究。

由于 DNA 是生命的遗传蓝图，了解 DNA 复制和基因组维持的机制一直是七十多年来人们积极关注的领域。DNA 复制领域的研究已经产生了有关许多复制蛋白的单个结构和功能的大量数据。这些研究包括机制方面和生化活性测定，通过纯化这些蛋白质变得可行，使它们在 体外 环境中能够进行细致的检查。因此，蛋白质纯化在大多数旨在揭示 DNA 复制机制的研究工作中成为一种不可或缺且无处不在的技术。

本文介绍了一种分离标记有 6X-组氨酸的 DNA 复制蛋白的方法，该蛋白已在细菌细胞中过表达。感兴趣的蛋白质是人皮瓣核酸内切酶 1 （FEN1），这是一种结构特异性核酸酶，在滞后链复制中起关键作用，也是碱基切除修复 （BER） 等 DNA 修复途径的关键参与者^1,2,3。FEN1 的主要功能是在 5′ 位移的皮瓣结构的基部切割，这是 DNA 复制或 BER 过程中出现的中间体。最初，评估 FEN1 酶活性的生化研究提出了一种“跟踪”机制，其中核酸酶会识别瓣结构的游离 5′-磷酸末端，然后沿着瓣部到达其基部，然后将其切割⁴。随后的研究表明，FEN1 通过“穿线”机制起作用，其中它首先与皮瓣的基部结合，然后在切割前将游离的 5′ 端穿过其活性位点（图 1）⁵。过表达和分离重组 FEN1 的能力促进了这些突破，使研究人员能够将其用于生化和结构研究。

亲和层析是一种常用的纯化 DNA 的分离方法。该技术利用靶蛋白对固定在树脂上的配体的可逆结合亲和力来特异性捕获目标蛋白。最广泛使用的生物亲和力之一是氨基酸、组氨酸和金属离子（如镍和钴）之间的强烈相互作用，因此可以捕获到带 Ni²⁺ 或 Co²⁺ 的树脂上。

编码一串 6-9 个组氨酸残基 （His） 的 DNA 序列经常掺入编码目标蛋白质（在 N 端或 C 端）的质粒构建体中，用 6X-His 标签或多聚 His 标签标记蛋白质。然后可以通过固定化金属亲和层析 （IMAC） 轻松纯化 His 标签蛋白，IMAC 是亲和层析的一种亚型，其中树脂上的金属离子捕获带有亲和标签的蛋白质，随后可以使用适当的洗脱剂洗脱。过渡金属离子（如 Ni²⁺ 和 Co²⁺ ）可以固定在源自 N，N，N’-三-（羧甲基）-乙二胺或次氮基三乙酸 （NTA） 基团⁶ 的琼脂糖或硅胶基质上。

众所周知，金属配体对物理、化学和生物因素的降解具有很强的抵抗力，并且比其他类型的配体具有这一优势^6,7。此外，His 标签是一个相对较小的标签，不会显著影响蛋白质结构或功能⁷。然而，在细菌表达系统中，许多染色体表达的蛋白质对金属离子具有亲和力，并且可能与靶蛋白共纯化。镍和钴是 IMAC 基质中使用的典型金属离子。Ni-NTA 填料和 TALON 钴基填料通常用于纯化 His 标签蛋白。

Ni-NTA 与 TALON
Ni-NTA 和 TALON 的相应金属离子通过 NTA 配体固定在填料上。Ni-NTA 被认为具有更高的结合载量，可结合高达 100 mg/mL 的蛋白质。这可以提高蛋白质产量，但需要注意的是，污染蛋白质可能会被共纯化。相比之下，该填料对 His 标签蛋白具有更高的结合特异性，并且可能能够产生更高纯度的馏分。在本研究中，我们旨在使用参考的自动快速蛋白质液相色谱系统 NGC 系统（参见 材料表）比较两种填料的纯化效率。

缓冲区和兼容性
在蛋白质纯化过程中，需要缓冲液进行细胞裂解、样品制备、填料平衡以及从填料中洗脱捕获的蛋白质。浓度高达 100 mM 的 Tris、MOPS 和 HEPES 缓冲液是已知的 Ni-NTA 填料兼容缓冲液。缓冲液通常包括还原剂，以防止蛋白质氧化和蛋白质聚集。然而，超过阈值限度时，还原剂可能会剥夺树脂中的金属离子。对于上述镍基和钴基树脂，β-巯基乙醇 （BME） 或二硫苏糖醇 （DTT） 等还原剂的推荐浓度低于 1 mM。

用于纯化 hFEN1 的缓冲液是含有 NaCl、BME、苯甲基磺酰氟 （PMSF）、EDTA 和甘油的 Tris 缓冲液。NaCl 将蛋白质维持在可溶性形式并破坏分子相互作用，例如 DNA 结合。BME 减少氧化蛋白，从而防止蛋白聚集。PMSF） 是一种蛋白酶抑制剂，可防止蛋白酶介导的靶蛋白降解。EDTA 可去除样品中的二价阳离子，阻止它们进入核酸酶和蛋白酶。甘油增强了水性蛋白质的稳定性。此外，裂解缓冲液含有完整的蛋白酶抑制剂片剂，以确保在细胞裂解过程中最大限度地保护靶蛋白免受降解蛋白酶的影响。平衡和洗脱缓冲液含有咪唑，洗脱缓冲液中含有更大量的咪唑，以便在洗脱过程中从树脂中置换结合的蛋白质。

下一代色谱 （NGC） 系统
该自动化中压色谱系统专为快速流动蛋白质液相色谱 （FPLC） 而设计，使用两个泵同时泵送两种不同的缓冲液，能够进样 250 μL 至 100 mL 的各种样品体积。样品定量环（该系统中称为 Dynaloop）可以进样更大的样品体积。该系统可以使用 Chromlab 软件进行操作，该软件有助于创建定制方法、操作纯化运行以及分析 UV 峰和蛋白质组分。