Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem

Er zijn tal van strategieën beschikbaar om de cellulaire biologie te begrijpen. De ene benadering omvat een top-downstrategie, waarbij genetische mutaties in een gen worden geïntroduceerd, gevolgd door de evaluatie van de resulterende fenotypische veranderingen in een modelorganisme. Omgekeerd houdt een reductionistische benadering de eerste opheldering in van moleculaire mechanismen en enzymatische functies van een bepaald eiwit, vergezeld van de karakterisering van de interacties met andere cellulaire componenten. Vervolgens wordt de impact van dit eiwit op een biologische route beoordeeld. Hoewel elke onderzoeksbenadering zijn inherente voordelen en beperkingen heeft, vereist het bereiken van een alomvattend begrip van een biologische route interdisciplinair onderzoek.

Omdat DNA de genetische blauwdruk van het leven is, is het begrijpen van de mechanismen van DNA-duplicatie en genoomonderhoud al meer dan zeven decennia een gebied van actieve interesse. Studies op het gebied van DNA-replicatie hebben uitgebreide gegevens opgeleverd over de individuele structuren en functies van talrijke replicatie-eiwitten. Deze onderzoeken, die mechanistische aspecten en biochemische activiteitstests omvatten, zijn mogelijk gemaakt door de zuivering van deze eiwitten, waardoor ze nauwgezet kunnen worden onderzocht in een in vitro omgeving. Bijgevolg komt eiwitzuivering naar voren als een onmisbare en alomtegenwoordige techniek in de meeste onderzoeksinspanningen die gericht zijn op het ontrafelen van mechanistische inzichten in DNA-replicatie.

Dit artikel presenteert een methodologie voor het isoleren van een DNA-replicatie-eiwit gelabeld met 6X-histidine, dat tot overexpressie is gebracht in bacteriële cellen. Het eiwit van belang is humaan flap endonuclease 1 (FEN1), een structuurspecifieke nuclease die een cruciale rol speelt bij achterblijvende strengreplicatie en ook een cruciale deelnemer is aan DNA-herstelroutes zoals base excision repair (BER)^1,2,3. De primaire functie van FEN1 is het splitsen aan de basis van een 5′-verplaatste flapstructuur, een tussenproduct dat ontstaat tijdens DNA-replicatie of BER. Aanvankelijk suggereerden biochemische onderzoeken die de enzymatische activiteit van FEN1 beoordeelden een “volgmechanisme”, waarbij de nuclease het vrije 5′-fosfaatuiteinde van een flapstructuur zou herkennen en vervolgens langs de flap naar de basis zou volgen voordat deze werd gesplitst⁴. Uit daaropvolgend onderzoek bleek dat FEN1 werkt via een “draadmechanisme”, waarbij het zich eerst bindt aan de basis van de flap en vervolgens het vrije 5′-uiteinde door zijn actieve plaats rijgt voorafgaand aan de splitsing (Figuur 1)⁵. Het vermogen om recombinant FEN1 tot overexpressie te brengen en te isoleren heeft deze doorbraken mogelijk gemaakt, waardoor onderzoekers het kunnen gebruiken in biochemisch en structureel onderzoek.

Affiniteitschromatografie is een veelgebruikte scheidingsmethode om DNA te zuiveren. Deze techniek maakt gebruik van de omkeerbare bindingsaffiniteit van doeleiwitten naar liganden die op een hars zijn geïmmobiliseerd om specifiek het eiwit van belang te vangen. Een van de meest gebruikte bio-affiniteiten is de robuuste interactie tussen het aminozuur, histidine en metaalionen zoals nikkel en kobalt en kan daarom worden opgevangen op een hars geladen met Ni²⁺ of Co²⁺.

De DNA-sequentie die codeert voor een reeks van 6-9 histidineresiduen (His) wordt vaak opgenomen in het plasmideconstruct dat codeert voor het eiwit van belang (bij de N-terminus of C-terminus), waarbij het eiwit wordt gelabeld met een 6X-His-tag of een poly-His-tag. Het His-gelabelde eiwit kan vervolgens gemakkelijk worden gezuiverd door geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC), een subtype van affiniteitschromatografie waarbij metaalionen op de hars eiwitten vangen met een affiniteitslabel, die later kunnen worden geëlueerd met behulp van geschikte elutiemiddelen. Overgangsmetaalionen zoals Ni²⁺ en Co²⁺ kunnen worden geïmmobiliseerd op agarose- of silicagelmatrices die zijn afgeleid van N,N,N’-tris-(carboxymethyl)-ethyleendiamine of nitrilotriazijnzuur (NTA) groepen⁶.

Van metaalliganden is bekend dat ze robuust zijn tegen degradatie door fysische, chemische en biologische factoren en dit voordeel hebben ten opzichte van andere soorten liganden ^6,7. Bovendien is de His-tag een relatief kleine tag en heeft deze geen significante invloed op de eiwitstructuur of -functie⁷. In een bacterieel expressiesysteem hebben veel chromosomaal tot expressie gebrachte eiwitten echter affiniteit met metaalionen en kunnen ze samen met het doeleiwit zuiveren. Nikkel en kobalt zijn de typische metaalionen die in IMAC-matrices worden gebruikt. De Ni-NTA-hars en de TALON-hars op kobaltbasis worden vaak gebruikt voor de zuivering van His-gelabelde eiwitten.

Ni-NTA versus TALON
De respectievelijke metaalionen van zowel Ni-NTA als TALON worden geïmmobiliseerd op de hars door middel van NTA-liganden. Ni-NTA wordt verondersteld een hogere bindingscapaciteit te hebben, tot 100 mg/ml eiwit. Dit kan resulteren in een hogere eiwitopbrengst, met het voorbehoud dat verontreinigende eiwitten mede gezuiverd kunnen worden. Daarentegen heeft de hars een hogere bindingsspecificiteit ten opzichte van His-gelabelde eiwitten en kan het mogelijk fracties van hogere zuiverheid produceren. In deze studie willen we de zuiveringsefficiëntie van beide harsen vergelijken met behulp van het geautomatiseerde snelle eiwitvloeistofchromatografiesysteem waarnaar wordt verwezen, het NGC-systeem (zie de materiaaltabel).

Buffers en compatibiliteit
Tijdens de eiwitzuivering zijn buffers nodig voor cellyse, monstervoorbereiding, harsevenwicht en elutie van het gevangen eiwit uit de hars. Tris-, MOPS- en HEPES-buffers tot een concentratie van 100 mM zijn de bekende compatibele buffers voor de Ni-NTA-hars. Buffers bevatten vaak reductiemiddelen om de oxidatie van eiwitten en eiwitaggregatie te voorkomen. Boven een drempelwaarde kunnen reductiemiddelen de hars echter van metaalionen ontdoen. De aanbevolen concentratie van reductiemiddelen zoals bèta-mercaptoethanol (BME) of dithiothreitol (DTT) ligt onder 1 mM voor de bovengenoemde harsen op basis van nikkel en kobalt.

De buffers voor de zuivering van hFEN1 zijn Tris-buffers die NaCl, BME, fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), EDTA en glycerol bevatten. NaCl houdt het eiwit in oplosbare vorm en verstoort moleculaire interacties zoals DNA-binding. BME vermindert geoxideerde eiwitten en voorkomt daardoor eiwitaggregatie. PMSF) is een proteaseremmer die protease-gemedieerde afbraak van doeleiwit voorkomt. EDTA elimineert tweewaardige kationen uit het monster, waardoor hun toegang tot nucleasen en proteasen wordt voorkomen. Glycerol verbetert de stabiliteit van het eiwit in waterige vorm. Bovendien bevat de lysisbuffer complete proteaseremmertabletten om maximale bescherming van het doeleiwit te garanderen tegen afbrekende proteasen tijdens cellyse. De evenwichts- en elutiebuffers bevatten imidazol, waarbij de elutiebuffer grotere hoeveelheden bevat voor de imidazol om het gebonden eiwit van de hars tijdens de elutie te verplaatsen.

Chromatografie van de volgende generatie (NGC) systeem
Dit geautomatiseerde medium-druk chromatografiesysteem, ontworpen voor fast-flow protein liquid chromatography (FPLC), maakt gebruik van twee pompen om tegelijkertijd twee verschillende buffers te pompen en is in staat om een breed scala aan monstervolumes van 250 μl tot 100 ml te injecteren. De monsterlus (in dit systeem bekend als de Dynaloop) maakt het mogelijk om grotere monstervolumes te injecteren. Het systeem kan worden bediend met behulp van de Chromlab-software, die het mogelijk maakt om op maat gemaakte methoden te maken, zuiveringsruns te manipuleren en UV-pieken en eiwitfracties te analyseren.