Количественная оценка связывающих взаимодействий между Cu(II) и пептидными остатками в присутствии и отсутствии хромофоров

Биология эволюционировала, чтобы использовать разнообразную химию ионов металлов, необходимых для жизни, чтобы адаптироваться и выжить в окружающей среде. По оценкам, 25-50% белков используют ионы металлов для структуры и функции¹. Особая роль и окислительно-восстановительное состояние иона металла напрямую связаны с составом и геометрией биологических лигандов, которые его координируют. Кроме того, окислительно-восстановительные активные ионы металлов, такие как Cu(II), должны жестко регулироваться, чтобы они не взаимодействовали с окислителями через Фентон-подобную химию с образованием активных форм кислорода (АФК)^2,3,4. Понимание режимов связывания и сродства, которые управляют его биохимией, должно помочь прояснить биологическую роль иона металла.

Многие методы используются для изучения связывающих взаимодействий металлов и пептидов. Это в основном спектроскопические методы, но также включают компьютерное моделирование с использованием молекулярной динамики, как видно через взаимодействия Cu(II) с фрагментом бета-амилоида (Aβ)⁵. Широко используемым спектроскопическим методом, доступным для многих университетов, является ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Используя парамагнитную природу Cu(II), Gaggelli et al. смогли показать, где ион металла связывается на петиде через расслабление близлежащих ядер⁶. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) также может быть использован для исследования местоположения и режима ионного связывания парамагнитного металла⁷. Другие спектроскопические методы, такие как круговой дихроизм (CD), могут описывать координацию относительно Cu(II) в таких системах, как трипептидные системы⁸, а масс-спектрометрия может показать стехиометрию и то, с какими остатками координируется ион металла через схемы фрагментации ^9,10.

Некоторые из этих методов, такие как ЯМР, не имеют меток, но требуют больших концентраций пептидов, что создает проблемы для изучения. Другой распространенный метод, называемый флуоресцентной спектроскопией, был использован для связи положения тирозина или триптофана с закалкой из Cu(II)^11,12. Аналогичным образом, этот метод может показать структурные изменения в результате связывания Cu(II)¹³. Однако проблемы с этими исследованиями связывания металлов с пептидами заключаются в том, что они исследуют хромофорные аминокислоты, такие как тирозин, которые есть не во всех системах, что ион металла связывается в классической модели и что метод может быть неблагоприятным в физиологических условиях. Действительно, появляется несколько пептидов, которые не содержат таких хромофорных аминокислот или связываются по классическим моделям, что исключает использование этих методов ^14,15. В этой статье подробно описываются подходы к оценке связывающих свойств в этих сценариях в физиологически значимых условиях.

Биологические лиганды могут принимать различные состояния протонирования, которые могут влиять на связывание ионов металлов, таких как имидазольное кольцо на гистидине. Если pH не поддерживается последовательно, результаты могут быть запутанными или противоречивыми. По этой причине буферы являются важным компонентом в изучении взаимодействия металл-белок/пептид. Однако было показано, что многие буферы благоприятно взаимодействуют с ионами металлов^16,17. В дополнение к конкуренции с интересующей биологической молекулой, буфер может иметь аналогичные координирующие атомы, которые может быть трудно отличить от координирующих атомов пептида или белка. В этом исследовании основное внимание уделяется электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии (ITC) в качестве двух взаимодополняющих методов изучения Cu(II)-пептидных взаимодействий с особыми соображениями, касающимися выбора буфера.

Электронная абсорбционная спектроскопия является быстрым, широко доступным методом изучения металлосвязывающих взаимодействий. Облучение светом в ультрафиолетовых (УФ) или видимых длинах волн может привести к поглощению металлоцентричных d-d полос, которые предоставляют ценную информацию о классификации лигандов, геометрии металлов и кажущемся сродстве связывания^18,19. Для этих комплексов прямое титрование ионов металлов в белковые или пептидные растворы может количественно определять стехиометрию связывания и кажущееся сродство связывания. В некоторых случаях, таких как d⁵ или d¹⁰ электронных конфигураций, комплекс не поглощает свет (т. е. спектроскопически бесшумен). В этих спектроскопически бесшумных комплексах переходных металлов эти ограничения можно обойти, используя конкурирующий лиганд, который при координации с ионом металла дает обнаруживаемые полосы переноса заряда. В любом случае этот подход ограничен количественной оценкой только стехиометрии и кажущегося сродства связывания, и никакое понимание энтальпии связывания не дается без приближений.

Дополняя информацию, полученную с помощью электронной абсорбционной спектроскопии, ITC является привлекательным методом для прямой и строгой количественной оценки энтальпии^{связывания 20}. ITC непосредственно измеряет тепло, выделяемое или потребляемое во время события связывания, и, поскольку титрование происходит при постоянном давлении, измеренное тепло является энтальпией всех равновесий (ΔH_ITC). Кроме того, количественно определяется стехиометрия события связывания (n) и кажущееся сродство связывания (K_ITC). Из этих параметров определяют свободную энергию (ΔG_ITC) и энтропию (ΔS_ITC), обеспечивая термодинамический снимок события связывания. Поскольку ITC не полагается на поглощение света, он является идеальным методом для спектроскопически бесшумных видов, например, d⁵ или d¹⁰ комплексов ионов металлов. Однако, поскольку калориметрия измеряет теплоту, любые непревзойденные буферные системы и неучтенные равновесия могут отрицательно повлиять на анализ для точного определения термодинамики связывания ионов металлов, и необходимо проявлять большую осторожность для устранения этих факторов²⁰. При выполнении с соответствующей строгостью ITC является надежным методом определения термодинамики металл-белково-пептидных комплексов.

Здесь хромофорически тихий медь-связывающий пептид, С-пептид, используется для демонстрации взаимодополняющего использования двух методов. С-пептид представляет собой продукт расщепления 31 остатка (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLGSL), образующийся при созревании инсулина; он не имеет хромофорных остатков, но было показано, что он связывает Cu(II) с физиологически значимым сродством^14,15. Сайт связывания Cu(II) состоит из боковых цепей глутамата и аспартата, а также N-конца пептида^14,15. Эти координирующие атомы очень похожи на атомы многих обычно используемых буферных систем. Здесь показано тандемное использование d-d и полос переноса заряда в электронной абсорбционной спектроскопии и ITC в количественной оценке термодинамики связывания Cu(II) с С-пептидом. Подход, основанный на изучении связывания Cu(II) с С-пептидом, может быть применен к другим ионам металлов и белково-пептидным системам.