Quantifizierung der Bindungswechselwirkungen zwischen Cu(II)- und Peptidresten in Gegenwart und Abwesenheit von Chromophoren

Die Biologie hat sich weiterentwickelt, um die vielfältige Chemie von Metallionen zu nutzen, die das Leben benötigt, um sich anzupassen und in seiner Umgebung zu überleben. Schätzungsweise 25%-50% der Proteine verwenden Metallionen für Struktur und Funktion¹. Die besondere Rolle und der Redoxzustand des Metallions stehen in direktem Zusammenhang mit der Zusammensetzung und Geometrie der biologischen Liganden, die es koordinieren. Darüber hinaus müssen redoxaktive Metallionen wie Cu(II) streng reguliert werden, damit sie nicht über Fenton-ähnliche Chemie mit Oxidationsmitteln wechselwirken, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS^{) zu bilden2,3,4}. Das Verständnis der Bindungsmodi und der Affinität, die seine Biochemie antreiben, sollte dazu beitragen, die biologische Rolle des Metallions aufzuklären.

Viele Techniken werden verwendet, um die Bindungswechselwirkungen von Metallen und Peptiden zu untersuchen. Dies sind meist spektroskopische Techniken, umfassen aber auch Computersimulationen unter Verwendung der Molekulardynamik, wie sie durch Cu (II) -Wechselwirkungen mit einem Fragment von Amyloid-Beta (^{Aβ) 5} gesehen werden. Eine weit verbreitete spektroskopische Technik, die vielen Universitäten zugänglich ist, ist die Kernspinresonanz (NMR). Durch die Verwendung der paramagnetischen Natur von Cu(II) konnten Gaggelli et al. zeigen, wo das Metallion durch Relaxation der nahen Kerne⁶ an ein Petide bindet. Die paramagnetische Elektronenresonanz (EPR) kann auch verwendet werden, um den Ort und den Modus der paramagnetischen Metallionenbindung⁷ zu untersuchen. Andere spektroskopische Techniken wie der zirkuläre Dichroismus (CD) können die Koordination über Cu(II) in Systemen wie Tripeptidsystemen⁸ beschreiben, und die Massenspektrometrie kann die Stöchiometrie zeigen und auf welche Reste das Metallion durch Fragmentierungsmuster koordiniert^{wird 9,10}.

Einige dieser Techniken, wie NMR, sind markierungsfrei, erfordern jedoch große Peptidkonzentrationen, was die Untersuchung vor Herausforderungen stellt. Eine andere gängige Technik, die als Fluoreszenzspektroskopie bezeichnet wird, wurde verwendet, um die Position eines Tyrosins oder Tryptophans mit dem Abschrecken aus einem Cu(II)^11,12 in Beziehung zu setzen. In ähnlicher Weise kann diese Technik strukturelle Veränderungen als Folge der Cu(II)-Bindung¹³ zeigen. Die Herausforderungen bei diesen Metall-Peptid-Bindungsstudien bestehen jedoch darin, dass sie chromophore Aminosäuren wie Tyrosin untersuchen, die nicht alle Systeme haben, dass das Metallion unter einem klassischen Modell bindet und dass die Technik unter physiologischen Bedingungen möglicherweise nicht förderlich ist. In der Tat entstehen mehrere Peptide, die solche chromophoren Aminosäuren nicht enthalten oder nach klassischen Modellen binden, was die Verwendung dieser Techniken ausschließt^14,15. Dieser Artikel beschreibt Ansätze zur Beurteilung von Bindungseigenschaften in diesen Szenarien unter physiologisch relevanten Bedingungen.

Biologische Liganden können verschiedene Protonierungszustände annehmen, die die Metallionenbindung beeinflussen können, wie z.B. den Imidazolring auf Histidin. Wenn der pH-Wert nicht konsequent aufrechterhalten wird, können die Ergebnisse verworren oder widersprüchlich sein. Aus diesem Grund sind Puffer ein wesentlicher Bestandteil bei der Untersuchung von Metall-Protein/Peptid-Wechselwirkungen. Es wurde jedoch gezeigt, dass viele Puffer günstig mit Metallionen^{interagieren 16,17}. Zusätzlich zum Wettbewerb mit dem interessierenden biologischen Molekül kann der Puffer ähnliche koordinierende Atome aufweisen, die von den koordinierenden Atomen des Peptids oder Proteins schwer zu unterscheiden sind. In dieser Studie liegt der Fokus auf der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) als zwei komplementäre Techniken zur Untersuchung von Cu(II)-Peptid-Wechselwirkungen, mit besonderen Überlegungen zur Pufferwahl.

Die elektronische Absorptionsspektroskopie ist eine schnelle, allgemein zugängliche Technik zur Untersuchung von Metallbindungswechselwirkungen. Die Bestrahlung mit Licht in den ultravioletten (UV) oder sichtbaren Wellenlängen kann zur Absorption von metallzentrierten d-d-Bändern führen, die wertvolle Informationen über Ligandenklassifizierung, Metallgeometrien und scheinbare Bindungsaffinitäten^{liefern 18,19}. Für diese Komplexe können direkte Titrationen von Metallionen in Protein- oder Peptidlösungen Bindungsstöchiometrien und scheinbare Bindungsaffinitäten quantifizieren. In einigen Fällen, wie z.B. d⁵ oder d¹⁰ Elektronenkonfigurationen, absorbiert der Komplex kein Licht (d.h. ist spektroskopisch stumm). In diesen spektroskopisch stillen Übergangsmetallkomplexen können diese Einschränkungen durch die Verwendung eines konkurrierenden Liganden umgangen werden, der bei Koordinierung auf das Metallion nachweisbare Ladungsübertragungsbänder ergibt. In beiden Fällen beschränkt sich dieser Ansatz darauf, nur die Stöchiometrie und die scheinbare Bindungsaffinität zu quantifizieren, und ohne Näherungen wird kein Einblick in die Bindungsenthalpie gegeben.

Ergänzend zu den Informationen aus der elektronischen Absorptionsspektroskopie ist ITC eine attraktive Technik zur direkten und rigorosen Quantifizierung der Bindungsenthalpie²⁰. ITC misst direkt die während eines Bindungsereignisses freigesetzte oder verbrauchte Wärme, und da die Titration bei konstantem Druck stattfindet, ist die gemessene Wärme die Enthalpie aller Gleichgewichte (ΔH_ITC). Zusätzlich werden die Stöchiometrie des Bindungsereignisses (n) und der scheinbaren Bindungsaffinität (K_ITC) quantifiziert. Aus diesen Parametern werden die freie Energie (ΔG ITC) und die Entropie (ΔS_ITC) bestimmt, wodurch eine thermodynamische Momentaufnahme des Bindungsereignisses bereitgestellt wird. Da es nicht auf Lichtabsorption angewiesen ist, ist ITC eine ideale Technik für spektroskopisch stumme Spezies, zum Beispiel d⁵ oder d¹⁰ Metallionenkomplexe. Da die Kalorimetrie jedoch die Wärme misst, können unübertroffene Puffersysteme und nicht berücksichtigte Gleichgewichte die Analyse beeinträchtigen, um die Metallionenbindungsthermodynamik genau zu bestimmen, und es muss große Sorgfalt darauf verwendet werden, diese Faktoren anzugehen²⁰. Wenn es mit der entsprechenden Strenge durchgeführt wird, ist ITC eine robuste Technik zur Bestimmung der Thermodynamik von Metall-Protein/Peptid-Komplexen.

Hier wird ein chromophorisch leises kupferbindendes Peptid, C-Peptid, verwendet, um die komplementäre Verwendung der beiden Techniken zu demonstrieren. C-Peptid ist ein 31-Restspaltprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ), das während der Insulinreifung gebildet wird; Es fehlen chromophore Rückstände, aber es wurde gezeigt, dass es Cu(II) mit physiologisch relevanter Affinität^14,15 bindet. Die Cu(II)-Bindungsstelle besteht aus den Seitenketten eines Glutamats und eines Aspartats sowie dem N-Terminus des Peptids^14,15. Diese koordinierenden Atome ähneln stark denen vieler häufig verwendeter gepufferter Systeme. Hier wird die Tandemverwendung der d-d- und Ladungstransferbänder in der elektronischen Absorptionsspektroskopie und ITC zur Quantifizierung der Cu(II)-Bindung der Thermodynamik an das C-Peptid gezeigt. Der Ansatz aus der Untersuchung der Cu(II)-Bindung an C-Peptid kann auf andere Metallionen und Protein/Peptid-Systeme angewendet werden.