概要

כימות אינטראקציות הקשירה בין שאריות Cu(II) ופפטידיות בנוכחות ובהיעדר כרומופורים

Published: April 05, 2022
doi:

概要

מאמר זה מתמקד בשימוש בספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית ובקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית כדי לחקור ולכמת את התרמודינמיקה של Cu(II) הקשורה לפפטידים וחלבונים.

Abstract

נחושת(II) היא מתכת חיונית במערכות ביולוגיות, המעניקה תכונות כימיות ייחודיות לביומולקולות שאיתן היא מתקשרת. דווח כי הוא נקשר ישירות למגוון פפטידים וממלא תפקידים הכרחיים ופתולוגיים כאחד, החל ממבנה מתווך, דרך תכונות העברת אלקטרונים וכלה בהקניית תפקוד קטליטי. כימות זיקת הקישור והתרמודינמיקה של קומפלקסים אלה של Cu(II)-פפטידים במבחנה מספק תובנה לגבי הכוח המניע התרמודינמי של הקשירה, תחרויות פוטנציאליות בין יוני מתכת שונים עבור הפפטיד או בין פפטידים שונים עבור Cu(II), והשכיחות של קומפלקס Cu(II)- פפטידי in vivo. עם זאת, כימות התרמודינמיקה הקושרת יכול להיות מאתגר בשל מספר עצום של גורמים, כולל התחשבות בכל שיווי המשקל המתחרה בניסוי טיטרציה, במיוחד במקרים שבהם יש מחסור בידיות ספקטרוסקופיות בדידות המייצגות את הפפטיד, את יון המתכת בלוק d ואת האינטראקציות שלהם.

כאן, קבוצה חזקה של ניסויים מסופקת לכימות מדויק של תרמודינמיקה Cu(II)-פפטידית. מאמר זה מתמקד בשימוש בספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית בנוכחות והיעדר ליגנדות כרומופוריות כדי לספק את הידית הספקטרוסקופית הדרושה ב- Cu(II) ובשימוש בקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית ללא תווית. בשתי הטכניקות הניסוייות מתואר תהליך כדי להסביר את כל שיווי המשקל המתחרה. בעוד שהמיקוד של מאמר זה הוא ב-Cu(II), קבוצת הניסויים המתוארת יכולה לחול מעבר לאינטראקציות Cu(II)-פפטידיות, ולספק מסגרת לכימות מדויק של מערכות מתכת-פפטידים אחרות בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

Introduction

הביולוגיה התפתחה כדי לנצל את הכימיה המגוונת של יוני המתכת הדרושים לחיים כדי להסתגל ולשרוד בסביבתם. על פי הערכות, 25%-50% מהחלבונים משתמשים ביוני מתכת למבנה ולתפקוד1. התפקיד המסוים ומצב החמצון מחדש של יון המתכת קשורים ישירות להרכב ולגיאומטריה של הליגנדות הביולוגיות המתאמות אותו. בנוסף, יוני מתכת פעילים בפני חמצון-חיזור כגון Cu(II) חייבים להיות מווסתים היטב, שמא הם מתקשרים עם חומרים מחמצנים באמצעות כימיה דמוית פנטון כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS)2,3,4. הבנת מצבי הקשירה והאהדה המניעים את הביוכימיה שלה אמורה לסייע בהבהרת התפקיד הביולוגי של יון המתכת.

טכניקות רבות משמשות לחקר אינטראקציות הקשירה של מתכות ופפטידים. אלה הן בעיקר טכניקות ספקטרוסקופיות, אך הן כוללות גם סימולציות מחשב באמצעות דינמיקה מולקולרית, כפי שניתן לראות באמצעות אינטראקציות Cu(II) עם קטע של עמילואיד בטא (Aβ)5. טכניקה ספקטרוסקופית נפוצה הנגישה לאוניברסיטאות רבות היא תהודה מגנטית גרעינית (NMR). על ידי שימוש באופי הפאראמגנטי של Cu(II), Gaggelli et al. הצליחו להראות היכן יון המתכת נקשר על פטיד באמצעות הרפיה של גרעינים סמוכים6. ניתן להשתמש בתהודה פאראמגנטית של אלקטרונים (EPR) גם כדי לחקור את המיקום והמצב של יון המתכת הפארמגנטיתהמחייבת 7. טכניקות ספקטרוסקופיות אחרות כגון דיכרואיזם מעגלי (CD) יכולות לתאר את הקואורדינציה לגבי Cu(II) במערכות כגון מערכות טריפפטידיות8, וספקטרומטריית מסות יכולה להראות סטויכיומטריה ולאילו שאריות יון המתכת מתואם באמצעות תבניות פיצול 9,10.

חלק מהטכניקות הללו, כגון NMR, הן נטולות תוויות אך דורשות ריכוזים גדולים של פפטידים, מה שמציב אתגרים למחקר. טכניקה נפוצה נוספת הנקראת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית שימשה כדי לקשר את מיקומו של טירוזין או טריפטופן עם מרווה מ-Cu(II)11,12. באופן דומה, טכניקה זו יכולה להראות שינויים מבניים כתוצאה מכריכת Cu(II)13. עם זאת, האתגרים עם מחקרי קשירת מתכות-פפטידים אלה הם שהם בודקים חומצות אמינו כרומופוריות כגון טירוזין אשר לא כל המערכות יש, כי יון המתכת נקשר תחת מודל קלאסי, וכי ייתכן שהטכניקה אינה תורמת בתנאים פיזיולוגיים. ואכן, נוצרים מספר פפטידים שאינם מכילים חומצות אמינו כרומופוריות כאלה או נקשרים תחת מודלים קלאסיים, מה שמונע את השימוש בטכניקות אלה14,15. מאמר זה מפרט גישות להערכת תכונות מחייבות בתרחישים אלה בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

ליגנדות ביולוגיות עשויות לאמץ מצבי פרוטונציה שונים שיכולים להשפיע על קשירת יוני מתכת כגון טבעת אימידזול על היסטידין. אם ה- pH אינו נשמר באופן עקבי, התוצאות יכולות להיות מפותלות או סותרות. מסיבה זו, מאגרים הם מרכיב חיוני בחקר האינטראקציות בין מתכת לחלבון/פפטיד. עם זאת, הוכח כי מאגרים רבים מקיימים אינטראקציה חיובית עם יוני מתכת16,17. בנוסף לתחרות עם המולקולה הביולוגית המעניינת, למאגר עשויים להיות אטומי תיאום דומים שקשה להבחין ביניהם לבין האטומים המתאמים של הפפטיד או החלבון. במחקר זה, ההתמקדות היא בספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית וקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית (ITC) כשתי טכניקות משלימות לחקר אינטראקציות Cu(II)-פפטיד, עם שיקולים מיוחדים הנוגעים לבחירת חיץ.

ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית היא טכניקה מהירה ונגישה לחקר אינטראקציות קושרות מתכות. הקרנה עם אור באורכי הגל האולטרה-סגולים (UV) או באורכי הגל הנראים לעין יכולה להוביל לקליטה של רצועות d-d ממוקדות מתכת, המספקות מידע רב ערך על סיווג ליגנד, גיאומטריות מתכתיות וזיקות קשירה לכאורה18,19. עבור קומפלקסים אלה, טיטרציות ישירות של יוני מתכת לתמיסות חלבון או פפטידים יכולות לכמת סטויכיומטריות קושרות וזיקות קישור לכאורה. במקרים מסוימים, כגון תצורות d5 או d10 אלקטרונים, הקומפלקס אינו בולע אור (כלומר, הוא שקט מבחינה ספקטרוסקופית). בקומפלקסים אלה של מתכת מעבר שקטה מבחינה ספקטרוסקופית, ניתן לעקוף מגבלות אלה על ידי שימוש בליגנד מתחרה, אשר בעת תיאום יון המתכת, מניב רצועות העברת מטען הניתנות לזיהוי. בכל מקרה, גישה זו מוגבלת לכימות רק סטויכיומטריה וזיקה מקשרת לכאורה, ואין תובנה לגבי אנתלפיה מחייבת ללא קירובים.

משלים מידע המתקבל מספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית, ITC היא טכניקה אטרקטיבית לכימות ישיר וקפדני של האנתלפיה המחייבת20. ITC מודד ישירות את החום המשתחרר או הנצרך במהלך אירוע מחייב, ומכיוון שהטיטרציה מתרחשת בלחץ קבוע, החום הנמדד הוא האנתלפיה של כל שיווי המשקל (ΔHITC). בנוסף, הסטויכיומטריה של אירוע הכריכיומטריה של אירוע הכריכה (n) וזיקת הכריכיון לכאורה (KITC) מכמתות. מפרמטרים אלה נקבעות האנרגיה החופשית (ΔGITC) והאנטרופיה (ΔSITC), המספקות תמונת מצב תרמודינמית של אירוע הקשירה. מכיוון שהוא אינו מסתמך על בליעת אור, ITC היא טכניקה אידיאלית עבור מינים שקטים באופן ספקטרוסקופי, למשל, d5 או d10 קומפלקסים של יונים מתכתיים. עם זאת, מכיוון שקלורימטריה מודדת חום, כל מערכות חיץ ללא תחרות ושיווי משקל ללא הסברה עלולים להשפיע לרעה על הניתוח כדי לקבוע במדויק את התרמודינמיקה הקושרת את יוני המתכת, ויש לנקוט בזהירות רבה כדי לטפל בגורמים אלה20. אם היא מבוצעת בקפדנות המתאימה, ITC היא טכניקה חזקה לקביעת התרמודינמיקה של קומפלקסים של חלבוני מתכת/פפטידים.

כאן, פפטיד קושר נחושת שקט כרומופורית, C-פפטיד, משמש להדגמת השימוש המשלים בשתי הטכניקות. C-פפטיד הוא מוצר ביקוע של 31 שאריות (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQSLQPLALEGSLQ) שנוצר במהלך הבשלת האינסולין; הוא חסר שאריות כרומופוריות, אך הוכח שהוא קושר את Cu(II) עם זיקה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית14,15. אתר הקישור Cu(II) מורכב משרשראות הצד של גלוטמט ואספרטאט וכן מ-N-terminus של הפפטיד14,15. אטומי תיאום אלה דומים מאוד לאלה של מערכות מאגרים נפוצות רבות. כאן מוצג השימוש הטנדם בפסי העברת ה-d-d והמטענים בספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית וב-ITC בכימות התרמודינמיקה הקושרת את ה-Cu(II) ל-C-פפטיד. ניתן ליישם את הגישה ממחקר Cu(II) הקושר ל-C-פפטיד על יוני מתכת אחרים ועל מערכות חלבון/פפטידים אחרות.

Protocol

1. ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית: טיטרציה ישירה עם תחרות חיץ הכנה לדוגמה הכינו תמיסה מואצת של 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(הידרוקסימתיל)פרופאן-1,3-דיול (bisTris) ב-pH 7.4 באמצעות מים אולטרה-אפורים (עמידות >18 MΩ). הסר את יוני המתכת של עקבות על ידי דגירה עם שרף בעל זיקה גבוהה למשך 2 שעות לפחות…

Representative Results

המטרה הייתה לכמת ולאשש את התרמודינמיקה של Cu(II) הנקשרת ל-C-פפטיד באמצעות הטכניקות המשלימות של ספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית ו-ITC. בשל האופי החזק של ספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית, בוצע טיטרציה ישירה של Cu(II) ל-300 μM C-peptide (איור 1). תוספת של 150 μM של Cu(II) גרמה לעלייה מיידית בפס ב-600 ננו?…

Discussion

מאמר זה מספק שיטה חזקה לכימות הזיקה והתרמודינמיקה של Cu(II) הקשורה לפפטידים. קומפלקסים עם Cu(II) מתאימים באופן אידיאלי לניטור רצועת הקליטה d-d באתר המתכת בשל תצורת האלקטרונים d9 שלה. אף על פי שמקדם ההכחדה הוא קטן, ולכן דורש ריכוזים גדולים יותר של הקומפלקס כדי להניב אות אמין, טיטרציות של Cu(II) ל…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SC מודה למלגת מחקר הקיץ של וייטהד. MJS מודה לקרנות הסטארט-אפ ולקרן לפיתוח הפקולטה באוניברסיטת סן פרנסיסקו. MCH מכיר במימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ומהקרן הלאומית למדע (NSF CAREER 2048265).

Materials

1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

参考文献

  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O’Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D’Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions – a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. . Inorganic Chemistry. , (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT – A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. . Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).

Play Video

記事を引用
Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

View Video