量化Cu（II）和肽残基在存在和不存在发色团的情况下的结合相互作用
概要
本文重点介绍使用电子吸收光谱和等温滴定量热法来探测和量化Cu（II）与肽和蛋白质结合的热力学。
Abstract
铜（II）是生物系统中的必需金属，赋予与其相互作用的生物分子独特的化学性质。据报道，它直接与多种肽结合，并发挥从介导结构到电子转移性质再到赋予催化功能的必要和病理作用。在 体外 量化这些Cu（II）肽复合物的结合亲和力和热力学，可以深入了解结合的热力学驱动力，不同金属离子之间对肽或不同肽之间对Cu（II）的潜在竞争，以及Cu（II）肽复合物 在体内的普遍性。然而，由于无数因素，量化结合热力学可能具有挑战性，包括考虑滴定实验中的所有竞争平衡，特别是在缺乏代表肽，d块金属离子及其相互作用的离散光谱手柄的情况下。
这里提供了一组可靠的实验，用于准确定量Cu（II）肽热力学。本文重点介绍在存在和不存在发色配体的情况下使用电子吸收光谱来提供Cu（II）所需的光谱处理，以及使用无标记等温滴定量热法。在这两种实验技术中，都描述了一个过程来解释所有竞争均衡。虽然本文的重点是Cu（II），但所描述的一组实验可以应用于Cu（II）-肽相互作用之外，并为在生理相关条件下准确定量其他金属肽系统提供框架。
Introduction
生物学已经发展到利用生命适应和生存周围环境所需的金属离子的多样化化学性质。估计有25%-50%的蛋白质使用金属离子来构建结构和功能1.金属离子的特殊作用和氧化还原状态与协调它的生物配体的组成和几何形状直接相关。此外，氧化还原活性金属离子（如Cu（II））必须受到严格调节，以免它们 通过 芬顿样化学与氧化剂相互作用形成活性氧（ROS）2，3，4。了解驱动其生物化学的结合模式和亲和力应有助于阐明金属离子的生物学作用。
许多技术用于研究金属和肽的结合相互作用。这些主要是光谱技术，但也包括使用分子动力学的计算机模拟，如Cu（II）与β（Aβ）β（Aβ）片段的相互作用所看到的。许多大学都可以使用的一种广泛使用的光谱技术是核磁共振（NMR）。通过使用Cu（II）的顺磁性，Gaggelli等人能够通过附近原子核6的松弛来显示金属离子在浮出物上结合的位置。电子顺磁共振（EPR）也可用于探测顺磁性金属离子结合7的位置和模式。其他光谱技术如圆二向色性（CD）可以描述三肽系统8等系统中关于Cu（II）的配位，质谱可以显示化学计量以及金属离子通过片段化模式9，10协调到哪些残基。
其中一些技术，如核磁共振，是无标记的，但需要大浓度的肽，这对研究提出了挑战。另一种称为荧光光谱的常用技术已被用于将酪氨酸或色氨酸的位置与Cu（II）11，12的淬火联系起来。类似地，这种技术可以显示Cu（II）结合13引起的结构变化。然而，这些金属肽结合研究的挑战在于，它们探测并非所有系统都具有的染色氨基酸，例如酪氨酸，金属离子在经典模式下结合，并且该技术在生理条件下可能不利于。事实上，一些肽正在出现，它们不含这种发色氨基酸或在经典模型下结合，排除了使用这些技术14，15。本文详细介绍了在生理相关条件下评估这些场景中的结合特性的方法。
生物配体可以采用不同的质子化状态，可以影响金属离子的结合，例如组氨酸上的咪唑环。如果 pH 值不能始终如一地维持，则结果可能会复杂或相互冲突。因此，缓冲液是金属 – 蛋白质/肽相互作用研究中的重要组成部分。然而，许多缓冲液已被证明与金属离子16，17有利地相互作用。除了与感兴趣的生物分子竞争外，缓冲液可能具有相似的配位原子，这些配位原子可能难以与肽或蛋白质的配位原子区分开来。在这项研究中，重点是电子吸收光谱和等温滴定量热法（ITC）作为研究Cu（II）肽相互作用的两种互补技术，并特别考虑了缓冲液的选择。
电子吸收光谱是一种快速，广泛可用的技术，用于研究金属结合相互作用。用紫外（UV）或可见光波长的光照射可导致金属中心的d-d波段的吸收，这提供了有关配体分类，金属几何形状和明显结合亲和力的宝贵信息18，19。对于这些复合物，将金属离子直接滴定到蛋白质或肽溶液中可以量化结合化学计量和明显的结合亲和力。在某些情况下，如d5 或d10 电子构型，该络合物不吸收光（即，在光谱上是沉默的）。在这些光谱上沉默的过渡金属配合物中，可以通过使用竞争配体来规避这些限制，该配体在与金属离子协调时产生可检测的电荷转移带。在任何一种情况下，这种方法仅限于量化化学计量和明显的结合亲和力，并且在没有近似的情况下没有提供关于结合焓的见解。
作为对从电子吸收光谱获得的信息的补充，ITC是一种有吸引力的技术，用于直接和严格定量结合焓20。ITC直接测量结合事件期间释放或消耗的热量，并且由于滴定是在恒定压力下进行的，因此测量的热量是所有平衡的焓（ΔHITC）。此外，还量化了结合事件（n）的化学计量和表观结合亲和力（KITC）。根据这些参数，确定自由能（ΔGITC）和熵（ΔSITC），提供结合事件的热力学快照。由于它不依赖于光吸收，因此ITC是光谱沉默物质的理想技术，例如d5 或d10 金属离子配合物。然而，由于量热法测量热量，任何不匹配的缓冲系统和未解释的平衡都可能对准确确定金属离子结合热力学的分析产生不利影响，并且必须非常小心地解决这些因素20。如果以适当的严格程度进行，ITC是一种用于确定金属 – 蛋白质/肽复合物热力学的强大技术。
在这里，使用染色体沉默的铜结合肽C肽来证明这两种技术的互补使用。C肽是在胰岛素成熟过程中形成的31个残基裂解产物;它缺乏发色残基，但已被证明与生理相关的亲和力14，15结合Cu（II）。Cu（II）结合位点由谷氨酸盐和天冬氨酸盐的侧链以及肽14，15的N末端组成。这些配位原子与许多常用缓冲系统的原子非常相似。这里，显示了电子吸收光谱学中d-d和电荷转移带的串联使用，以及ITC在量化Cu（II）与C肽结合热力学中的串联使用。研究Cu（II）与C肽结合的方法可应用于其他金属离子和蛋白质/肽系统。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文为量化Cu（II）与肽结合的亲和力和热力学提供了一种可靠的方法。含有Cu（II）的配合物由于其d 9电子构型而非常适合监测金属位点的d-d 吸收带。虽然消光系数很小，因此需要较大浓度的复合物才能产生可靠的信号，但将Cu（II）滴定成肽可以快速提供对结合化学计量和近似结合亲和力的见解。然而，如果金属由缓冲液和肽的相似原子和几何形状协调，则辨别光谱的差异可能具有挑战?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SC感谢怀特黑德暑期研究奖学金。MJS感谢旧金山大学的创业基金和教师发展基金。MCH承认来自美国国立卫生研究院（NIH MIRA 5R35GM133684-02）和美国国家科学基金会（NSF CAREER 2048265）的资助。
Materials
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
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