概要

Quantificare le interazioni di legame tra Cu(II) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori

Published: April 05, 2022
doi:

概要

Questo articolo si concentra sull’uso della spettroscopia di assorbimento elettronica e della calorimetria di titolazione isotermica per sondare e quantificare la termodinamica del legame di Cu(II) a peptidi e proteine.

Abstract

Il rame (II) è un metallo essenziale nei sistemi biologici, conferendo proprietà chimiche uniche alle biomolecole con cui interagisce. È stato riportato che si lega direttamente a una varietà di peptidi e svolge ruoli sia necessari che patologici che vanno dalla struttura mediatrice alle proprietà di trasferimento degli elettroni all’impartire la funzione catalitica. Quantificare l’affinità di legame e la termodinamica di questi complessi peptidici Cu(II) in vitro fornisce informazioni sulla forza motrice termodinamica del legame, sulle potenziali competizioni tra diversi ioni metallici per il peptide o tra diversi peptidi per Cu(II) e sulla prevalenza del complesso Cu(II)-peptide in vivo. Tuttavia, quantificare la termodinamica di legame può essere difficile a causa di una miriade di fattori, tra cui la contabilità di tutti gli equilibri concorrenti all’interno di un esperimento di titolazione, specialmente nei casi in cui vi è una mancanza di maniglie spettroscopiche discrete che rappresentano il peptide, lo ione metallico d-block e le loro interazioni.

Qui, viene fornita una robusta serie di esperimenti per la quantificazione accurata della termodinamica del peptide Cu(II). Questo articolo si concentra sull’uso della spettroscopia di assorbimento elettronico in presenza e assenza di ligandi cromoforici per fornire la necessaria maniglia spettroscopica su Cu (II) e l’uso della calorimetria isotermica a titolazione senza etichetta. In entrambe le tecniche sperimentali, viene descritto un processo per tenere conto di tutti gli equilibri concorrenti. Mentre il focus di questo articolo è su Cu(II), l’insieme descritto di esperimenti può applicarsi oltre le interazioni Cu(II)-peptide e fornire un quadro per una quantificazione accurata di altri sistemi metallo-peptidi in condizioni fisiologicamente rilevanti.

Introduction

La biologia si è evoluta per utilizzare la diversa chimica degli ioni metallici necessari alla vita per adattarsi e sopravvivere nell’ambiente circostante. Si stima che il 25%-50% delle proteine utilizzi ioni metallici per la struttura e la funzione1. Il particolare ruolo e stato redox dello ione metallico è direttamente correlato alla composizione e alla geometria dei ligandi biologici che lo coordinano. Inoltre, gli ioni metallici redox-attivi come Cu(II) devono essere strettamente regolati per timore che interagiscano con agenti ossidanti attraverso la chimica simile a Fenton per formare specie reattive dell’ossigeno (ROS)2,3,4. Comprendere i modi di legame e l’affinità che guidano la sua biochimica dovrebbe aiutare a chiarire il ruolo biologico dello ione metallico.

Molte tecniche sono utilizzate per studiare le interazioni di legame di metalli e peptidi. Queste sono per lo più tecniche spettroscopiche, ma includono anche simulazioni al computer che utilizzano la dinamica molecolare, come visto attraverso le interazioni Cu (II) con un frammento di amiloide-beta (Aβ) 5. Una tecnica spettroscopica ampiamente utilizzata che è accessibile a molte università è la risonanza magnetica nucleare (NMR). Usando la natura paramagnetica di Cu(II), Gaggelli et al. sono stati in grado di mostrare dove lo ione metallico si lega su un petide attraverso il rilassamento dei nuclei vicini6. La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) può anche essere utilizzata per sondare la posizione e la modalità del legame ionico metallico paramagnetico7. Altre tecniche spettroscopiche come il dicroismo circolare (CD) possono descrivere il coordinamento su Cu(II) in sistemi come i sistemi tripartitici8, e la spettrometria di massa può mostrare stechiometria e a quali residui lo ione metallico è coordinato attraverso modelli di frammentazione 9,10.

Alcune di queste tecniche, come la NMR, sono prive di etichette ma richiedono grandi concentrazioni di peptide, ponendo sfide per lo studio. Un’altra tecnica comune chiamata spettroscopia di fluorescenza è stata utilizzata per mettere in relazione la posizione di una tirosina o triptofano con la tempra da un Cu(II)11,12. Allo stesso modo, questa tecnica può mostrare cambiamenti strutturali come risultato del legame Cu(II)13. Tuttavia, le sfide con questi studi di legame metallo-peptide sono che sondano gli amminoacidi cromoforici come la tirosina che non tutti i sistemi hanno, che lo ione metallico si lega sotto un modello classico e che la tecnica potrebbe non essere favorevole in condizioni fisiologiche. In effetti, stanno emergendo diversi peptidi che non contengono tali amminoacidi cromoforici o si legano sotto modelli classici, precludendo l’uso di queste tecniche14,15. Questo articolo descrive in dettaglio gli approcci per valutare le proprietà di legame in questi scenari in condizioni fisiologicamente rilevanti.

I ligandi biologici possono adottare diversi stati di protonazione che possono influenzare il legame con ioni metallici come l’anello imidazolo sull’istidina. Se il pH non viene mantenuto in modo coerente, i risultati possono essere contorti o conflittuali. Per questo motivo, i tamponi sono una componente essenziale nello studio delle interazioni metallo-proteina/peptide. Tuttavia, molti buffer hanno dimostrato di interagire favorevolmente con gli ioni metallici16,17. Oltre a competere con la molecola biologica di interesse, il buffer può avere atomi di coordinamento simili che possono essere difficili da distinguere dagli atomi coordinati del peptide o della proteina. In questo studio, l’attenzione si concentra sulla spettroscopia di assorbimento elettronico e sulla calorimetria a titolazione isotermica (ITC) come due tecniche complementari per lo studio delle interazioni Cu(II)-peptide, con considerazioni speciali riguardanti la scelta del tampone.

La spettroscopia elettronica di assorbimento è una tecnica rapida e ampiamente accessibile per lo studio delle interazioni metallo-legame. L’irradiazione con la luce nelle lunghezze d’onda ultraviolette (UV) o visibili può portare all’assorbimento di bande d-d centrate sul metallo, che forniscono preziose informazioni sulla classificazione dei ligandi, sulle geometrie dei metalli e sulle apparenti affinità di legame18,19. Per questi complessi, le titolazioni dirette di ioni metallici in soluzioni proteiche o peptidiche possono quantificare le stechiometrie di legame e le apparenti affinità di legame. In alcuni casi, come le configurazioni di elettroni d5 o d10, il complesso non assorbe la luce (cioè è spettroscopicamente silenzioso). In questi complessi di metalli di transizione spettroscopicamente silenziosi, queste limitazioni possono essere aggirate utilizzando un ligando concorrente che, coordinandosi con lo ione metallico, produce bande di trasferimento di carica rilevabili. In entrambi i casi, questo approccio si limita a quantificare solo la stechiometria e l’apparente affinità di legame, e nessuna comprensione dell’entalpia di legame è fornita senza approssimazioni.

Integrando le informazioni ottenute dalla spettroscopia elettronica di assorbimento, l’ITC è una tecnica interessante per la quantificazione diretta e rigorosa dell’entalpiadi legame 20. ITC misura direttamente il calore rilasciato o consumato durante un evento legante e, poiché la titolazione avviene a pressione costante, il calore misurato è l’entalpia di tutti gli equilibri (ΔHITC). Inoltre, la stechiometria dell’evento di legame (n) e l’apparente affinità di legame (KITC) sono quantificate. Da questi parametri vengono determinate l’energia libera (ΔGITC) e l’entropia (ΔSITC), fornendo un’istantanea termodinamica dell’evento di legame. Poiché non si basa sull’assorbimento della luce, ITC è una tecnica ideale per specie spettroscopicamente silenziose, ad esempio complessi di ioni metallici d5 o d10 . Tuttavia, poiché la calorimetria misura il calore, qualsiasi sistema tampone senza pari e gli equilibri non contabilizzati possono influire negativamente sull’analisi per determinare con precisione la termodinamica legante gli ioni metallici e occorre prestare molta attenzione per affrontare questi fattori20. Se eseguita con il rigore appropriato, l’ITC è una tecnica robusta per determinare la termodinamica dei complessi metallo-proteina/peptide.

Qui, un peptide legante il rame cromoforicamente silenzioso, il peptide C, viene utilizzato per dimostrare l’uso complementare delle due tecniche. Il peptide C è un prodotto di scissione di 31 residui (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formato durante la maturazione dell’insulina; manca di residui cromoforici ma ha dimostrato di legare Cu(II) con affinità fisiologicamente rilevante14,15. Il sito di legame Cu(II) è costituito dalle catene laterali di un glutammato e di un aspartato, nonché dall’N-terminale del peptide14,15. Questi atomi di coordinamento assomigliano molto a quelli di molti sistemi tamponati comunemente usati. Qui, viene mostrato l’uso in tandem delle bande d-d e di trasferimento di carica nella spettroscopia elettronica di assorbimento e ITC nel quantificare la termodinamica di legame Cu(II) al peptide C. L’approccio derivante dallo studio del legame di Cu(II) al peptide C può essere applicato ad altri ioni metallici e sistemi proteici/peptidici.

Protocol

1. Spettroscopia elettronica di assorbimento: titolazione diretta con competizione tampone Preparazione del campione Preparare una soluzione tamponata di 50 mM 2-[bis(2-idrossietil)ammino]-2-(idrossimetil)propano-1,3-diolo (bisTris) a pH 7,4 utilizzando acqua ultrapura (resistenza >18 MΩ). Rimuovere gli ioni metallici in traccia incubandoli con una resina ad alta affinità per almeno 2 ore con successiva filtrazione. Sciogliere o diluire una quantità nota del peptide nel ta…

Representative Results

L’obiettivo era quello di quantificare e corroborare la termodinamica del legame di Cu(II) al peptide C utilizzando le tecniche complementari della spettroscopia elettronica di assorbimento e dell’ITC. A causa della natura robusta della spettroscopia elettronica di assorbimento, è stata eseguita una titolazione diretta di Cu(II) in 300 μM di peptide C (Figura 1). L’aggiunta di 150 μM di Cu(II) ha causato un immediato aumento della banda a 600 nm, attribuito alla banda d-d di Cu(II), e ha …

Discussion

Questo articolo fornisce un metodo robusto per quantificare l’affinità e la termodinamica del legame di Cu(II) ai peptidi. I complessi con Cu(II) sono ideali per monitorare la banda di assorbimento d-d nel sito metallico grazie alla sua configurazione di elettroni d9 . Sebbene il coefficiente di estinzione sia piccolo, richiedendo quindi concentrazioni maggiori del complesso per produrre un segnale affidabile, le titolazioni di Cu(II) in peptide possono fornire rapidamente informazioni sulla stechiometria di …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SC ringrazia la Whitehead Summer Research Fellowship. MJS ringrazia gli Startup Funds e il Faculty Development Fund dell’Università di San Francisco. MCH riconosce i finanziamenti del National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) e della National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

Materials

1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

参考文献

  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O’Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D’Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions – a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. . Inorganic Chemistry. , (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT – A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. . Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).

Play Video

記事を引用
Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

View Video