概要

Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen

Published: March 16, 2022
doi:

概要

Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.

Abstract

Dynamische Fusionsporenöffnung und -verschluss vermitteln Exozytose und Endozytose und bestimmen deren Kinetik. Hier wird detailliert demonstriert, wie die konfokale Mikroskopie in Kombination mit der Patch-Clamp-Aufzeichnung eingesetzt wurde, um drei Fusionsmodi in Primärkultur-Rindernebennieren-Chromaffinzellen nachzuweisen. Die drei Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt) mit Fusionsporenöffnung und -verschluss, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, bei der das fusionserzeugte Ω-Form-Profil geschrumpft wird, bis es vollständig an der Plasmamembran verschmilzt.

Um diese Fusionsmodi nachzuweisen, wurde die Plasmamembran durch Überexpression von mNeonGreen markiert, das mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH-mNG) verbunden ist, die an Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PtdIns(4,5)P2) an der Zytosol-zugewandten Packungsbeilage der Plasmamembran bindet; Vesikel wurden mit dem fluoreszierenden falschen Neurotransmitter FFN511 beladen, um die Freisetzung von vesikulärem Inhalt nachzuweisen; und Atto 655 wurde in die Badlösung aufgenommen, um einen Fusionsporenverschluss zu erkennen. Diese drei fluoreszierenden Sonden wurden gleichzeitig mit ~ 20-90 ms pro Bild in lebenden Chromaffinzellen abgebildet, um die Öffnung der Fusionsporen, die Freisetzung von Inhalten, den Fusionsporenverschluss und die Änderung der Fusionsvesikelgröße zu erkennen. Die Analysemethode wird beschrieben, um drei Fusionsmodi von diesen Fluoreszenzmessungen zu unterscheiden. Das hier beschriebene Verfahren kann prinzipiell auf viele sekretorische Zellen jenseits von Chromaffinzellen angewendet werden.

Introduction

Die Membranfusion vermittelt viele biologische Funktionen, einschließlich synaptischer Übertragung, Blutzuckerhomöostase, Immunantwort und viralem Eintritt 1,2,3. Exozytose, bei der die Vesikelfusion an der Plasmamembran stattfindet, setzt Neurotransmitter und Hormone frei, um viele wichtige Funktionen wie neuronale Netzwerkaktivitäten zu erreichen. Fusion öffnet eine Pore, um vesikulären Inhalt freizusetzen, wonach sich die Pore schließen kann, um das fusionierende Vesikel zu erhalten, das als Kiss-and-Run 1,4 bezeichnet wird. Sowohl irreversible als auch reversible Fusionsporenöffnung können mit zellgebundenen Kapazitätsaufzeichnungen in Kombination mit Fusionsporenleitfähigkeitsaufzeichnungen der Einzelvesikelfusion gemessen werden.

Dies wird oft so interpretiert, dass es die vollständige Kollapsfusion widerspiegelt, bei der die Fusion bis zur Abflachung des Schmelzvesikels dilatiert wird, und Kiss-and-Run, bei dem die Fusionsporen geöffnet und geschlossen werden, bzw. 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Jüngste konfokale und stimulierte Emissionsdepletionsstudien (STED) in chromaffinen Zellen beobachteten direkt die Öffnung und den Verschluss der Fusionsporen (Kiss-and-Run, auch Close-Fusion genannt), die Fusionsporenöffnung, die lange Zeit eine Ω-Form mit einer offenen Pore beibehält, die als Stay-Fusion bezeichnet wird, und das Schrumpfen des Fusionsvesikels, bis es vollständig mit der Plasmamembran verschmilzt, die die vollständige Kollapsfusion für die Verschmelzung von Fusionsvesikeln mit der Plasmamembran4 ersetzt. 8,14,15,16,17.

In Neuronen wurde die Öffnung und der Verschluss der Fusionsporen mit Bildgebung nachgewiesen, die die Freisetzung von Quantenpunkten zeigt, die in Vesikeln vorgeladen sind, die größer als die Fusionspore sind, und mit Fusionsporenleitfähigkeitsmessungen an der Freisetzungsfläche von Nerventerminals 5,18,19. Nebennierenchromaffinzellen werden häufig als Modell für die Untersuchung von Exo- und Endozytoseverwendet 20,21. Obwohl Chromaffinzellen große Vesikel mit dichtem Kern enthalten, während Synapsen kleine synaptische Vesikel enthalten, sind die Exozytose- und Endozytoseproteine in chromaffinen Zellen und Synapsen ziemlich analog 10,11,12,20,21,22,23.

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um diese drei Fusionsmodi mit einem konfokalen Bildgebungsverfahren in Kombination mit Elektrophysiologie in Rindernebennieren-Chromaffinzellen zu messen (Abbildung 1). Diese Methode beinhaltet das Laden von fluoreszierenden falschen Neurotransmittern (FFN511) in Vesikel, um Exozytose zu erkennen; Zugabe von Atto 655 (A655) in der Badlösung, um das fusionserzeugte Ω-Form-Profil zu füllen, und Markierung der Plasmamembran mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH), die an PtdIns(4,5)P2 an der Plasmamembran 8,15,24 bindet. Die Dynamik der Fusionsporen kann durch Änderungen verschiedener Fluoreszenzintensitäten nachgewiesen werden. Obwohl für Chromaffinzellen beschrieben, kann das hier beschriebene Prinzip dieser Methode weit über Chromaffinzellen hinaus auf viele sekretorische Zellen angewendet werden.

Protocol

HINWEIS: Das Tierverwendungsverfahren entsprach den NIH-Richtlinien und wurde vom NIH Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Rinderchromaffin-Zellkultur Bereiten Sie Lockes Lösung (Tabelle 1) und Autoklavwerkzeuge 1 Tag vor der Chromaffin-Zellkultur vor. Erhalten Sie am Kulturtag Rindernebennieren von einem lokalen Schlachthof und halten Sie sie vor der Dissektion in eiskalte Locke-Lösung getaucht.HINWEIS: Nebennieren sind von 21…

Representative Results

Nach den in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten experimentellen Verfahren wurden chromaffine Zellen aus den Nebennieren der Rinder mit PH-mNG transfiziert, um die Plasmamembran zu markieren; A655 wurde der Badlösung hinzugefügt, um einen Fusionsporenverschluss zu erkennen; und der fluoreszierende falsche Neurotransmitter FFN511 wurde in Vesikel geladen, um die Freisetzung nachzuweisen. Als nächstes wurde die konfokale Zeitrafferbildgebung der XY-Ebene von F…

Discussion

Ein konfokales mikroskopisches Bildgebungsverfahren wird beschrieben, um die Dynamik der Fusionsporen- und Transmitterfreisetzung sowie drei Fusionsmodi, Close-Fusion, Stay-Fusion und Shrink-Fusion in bovinen Nebennieren-Chromaffin-Zellenzu erkennen 4,24. Es wird eine elektrophysiologische Methode beschrieben, um die Zelle zu depolarisieren und dadurch Exo- und Endozytose hervorzurufen. Die systematische konfokale Bildverarbeitung liefert Informationen über vers…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 und ZIA NS003105-08) für die Unterstützung dieser Arbeit.

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

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記事を引用
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

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