概要

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

Published: March 16, 2022
doi:

概要

このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。

Abstract

動的融合細孔開閉は、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを媒介し、それらの動態を決定する。ここでは、共焦点顕微鏡をパッチクランプ記録と組み合わせて使用して、初代培養ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出する方法を詳細に実証する。3つの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う密閉核(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口と開いた細孔の維持を含むステイ融合、3)核融合によって生成されたΩ形プロファイルの収縮を伴う蠕動融着が含まれる原形膜で完全に融合する。

これらの融合モードを検出するために、原形質膜を標識し、原形質膜の細胞質ゾル対向小葉においてホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸(PtdIns(4,5)P2)に結合するホスホリパーゼC δ(PH-mNG)のPHドメインと結合するmNeonGreenを過剰発現させた。小胞に蛍光偽神経伝達物質FFN511をロードして、小胞内容物放出を検出した。Atto 655を融合孔閉鎖を検出するために浴液に含ませた。これら3つの蛍光プローブを生クロマフィン細胞で1フレームあたり約20〜90ミリ秒で同時に画像化し、融合孔開口、内容物放出、融合細孔閉鎖、および融合小胞サイズ変化を検出した。分析方法は、これらの蛍光測定から3つの融合モードを区別するために説明されています。ここで説明する方法は、原則として、クロマフィン細胞以外の多くの分泌細胞に適用することができる。

Introduction

膜融合は、シナプス伝達、血糖恒常性、免疫応答、およびウイルス侵入を含む多くの生物学的機能を媒介する1,2,3原形質膜での小胞融合を伴うエキソサイトーシスは、神経伝達物質およびホルモンを放出し、ニューロンネットワーク活動などの多くの重要な機能を達成する。融合は、小胞内容物を放出するために細孔を開き、その後、細孔が融合小胞を取り出すために閉じ得る、これはキスアンドラン1,4と呼ばれる。不可逆的および可逆的な融合孔開口の両方は、単一小胞融合の融合細孔コンダクタンス記録と組み合わせた細胞付着容量記録で測定することができる。

これはしばしば、融合小胞の平坦化までの融合の拡張を伴う完全崩壊融合、および融合孔の開閉を伴うキスアンドランを反映していると解釈され、それぞれ5678910、111213.クロマフィン細胞における最近の共焦点および誘導放出枯渇(STED)イメージング研究は、融合孔の開閉(キスアンドラン、クローズフュージョンとも呼ばれる)、ステーフュージョンと呼ばれる、長期間にわたって開いた細孔でΩ形状を維持する融合ポア開口部、および原形質膜と完全に融合するまでの融合小胞の収縮、原形質膜と融合小胞を融合させるための完全崩壊融合を置き換える4 8,14,15,16,17。

ニューロンにおいて、融合細孔の開閉は、融合孔よりも大きい小胞に予め装填された量子ドットの放出を示す画像化および神経終末の放出面における融合細孔コンダクタンス測定51819によって検出されている。副腎クロマフィン細胞は、外細胞症およびエンドサイトーシスの研究のためのモデルとして広く使用されている20,21。クロマフィン細胞は大きな緻密なコア小胞を含むが、シナプスは小さなシナプス小胞を含むが、クロマフィン細胞およびシナプスにおけるエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスタンパク質は、10、11122021、2223と非常に類似している。

ここでは、ウシ副腎クロマフィン細胞における電気生理学と組み合わせた共焦点イメージング法を用いてこれら3つの融合モードを測定する方法について説明する(図1)。この方法は、エキソサイトーシスを検出するために小胞に蛍光偽神経伝達物質(FFN511)をロードすることを含む。Atto 655(A655)を浴液に添加して融合生成したΩ形プロファイルを充填し、原形質膜81524でPtdIns(4,5)P2に結合するホスホリパーゼC δ(PH)のPHドメインで原形質膜を標識する。融合細孔ダイナミクスは、異なる蛍光強度の変化によって検出することができる。クロマフィン細胞について記載されているが、ここで説明するこの方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。

Protocol

注:動物の使用手順はNIHのガイドラインに従い、NIH動物愛護および使用委員会によって承認されました。 1. ウシクロマフィン細胞培養 クロマフィン細胞培養の1日前にロックの溶液(表1)とオートクレーブツールを調製する。 培養日に地元の食肉処理場からウシ副腎を入手し、解剖前に氷冷したロックの溶液に沈めておく。注:副?…

Representative Results

図1および図2に示される実験手順に従って、ウシ副腎由来のクロマフィン細胞をPH−mNGでトランスフェクトし、原形質膜を標識した。A655を浴液に添加して、融合孔閉鎖を検出した。蛍光偽神経伝達物質FFN511を放出の検出のために小胞に装填した。次に、FFN511、PH-mNG、およびA655のXY面共焦点タイムラプスイメージングを、細胞底部(細胞膜上方のZ焦点…

Discussion

共焦点顕微鏡画像化法は、ウシ副腎クロマフィン細胞4,24における融合孔および伝達物質放出のダイナミクス、ならびに3つの融合モード、近接融合、ステイ融合、および収縮融合を検出するために記載されている4,24。細胞を脱分極させ、それによってエキソ細胞症およびエンドサイトーシスを呼び起こす電気生理学的方法が記載されている。体系?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、この作業を支援してくれたNINDS壁内研究プログラム(ZIA NS003009-13およびZIA NS003105-08)に感謝する。

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

参考文献

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記事を引用
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

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