概要

Microscopie confocale pour mesurer trois modes de dynamique des pores de fusion dans les cellules chromaffines surrénales

Published: March 16, 2022
doi:

概要

Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale permettant de détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines. Ces modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant un rétrécissement des vésicules fusionnées.

Abstract

L’ouverture et la fermeture dynamiques des pores de fusion médient l’exocytose et l’endocytose et déterminent leur cinétique. Ici, il est démontré en détail comment la microscopie confocale a été utilisée en combinaison avec l’enregistrement patch-clamp pour détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines en culture primaire. Les trois modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant le retrait du profil en forme de Ω généré par la fusion jusqu’à ce qu’il fusionne complètement au niveau de la membrane plasmique.

Pour détecter ces modes de fusion, la membrane plasmique a été marquée en surexprimant mNeonGreen attaché au domaine PH de la phospholipase C δ (PH-mNG), qui se lie au phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) au niveau de la feuillet face au cytosol de la membrane plasmique; les vésicules ont été chargées avec le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 pour détecter la libération de contenu vésiculeux; et Atto 655 a été inclus dans la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion. Ces trois sondes fluorescentes ont été imagées simultanément à environ 20-90 ms par image dans des cellules chromaffines vivantes pour détecter l’ouverture des pores de fusion, la libération de contenu, la fermeture des pores de fusion et les changements de taille des vésicules de fusion. La méthode d’analyse est décrite pour distinguer trois modes de fusion de ces mesures de fluorescence. La méthode décrite ici peut, en principe, s’appliquer à de nombreuses cellules sécrétoires au-delà des cellules chromaffines.

Introduction

La fusion membranaire médie de nombreuses fonctions biologiques, y compris la transmission synaptique, l’homéostasie de la glycémie, la réponse immunitaire et l’entrée virale 1,2,3. L’exocytose, impliquant la fusion des vésicules au niveau de la membrane plasmique, libère des neurotransmetteurs et des hormones pour atteindre de nombreuses fonctions importantes, telles que les activités du réseau neuronal. La fusion ouvre un pore pour libérer le contenu vésiculeux, après quoi le pore peut se fermer pour récupérer la vésicule de fusion, appelée baiser et courir 1,4. L’ouverture irréversible et réversible des pores de fusion peut être mesurée avec des enregistrements de capacité attachés à des cellules combinés à des enregistrements de conductance des pores de fusion de fusion de vésicules uniques.

Ceci est souvent interprété comme reflétant la fusion d’effondrement complet, impliquant la dilatation de la fusion jusqu’à l’aplatissement de la vésicule de fusion, et le baiser et le run, impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, respectivement 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Des études récentes d’imagerie par épuisement des émissions confocales et stimulées (STED) dans des cellules chromaffines ont directement observé l’ouverture et la fermeture des pores de fusion (kiss-and-run, également appelée fusion fermée), l’ouverture des pores de fusion qui maintient une forme de Ω avec un pore ouvert pendant une longue période, appelée stay-fusion, et le rétrécissement de la vésicule de fusion jusqu’à ce qu’elle fusionne complètement avec la membrane plasmique, ce qui remplace la fusion à effondrement complet pour fusionner les vésicules de fusion avec la membrane plasmique4, 8,14,15,16,17.

Dans les neurones, l’ouverture et la fermeture des pores de fusion ont été détectées par imagerie montrant la libération de points quantiques préchargés dans des vésicules plus grandes que le pore de fusion et avec des mesures de conductance des pores de fusion à la face de libération des terminaisons nerveuses 5,18,19. Les cellules chromaffines surrénales sont largement utilisées comme modèle pour l’étude de l’exo- et de l’endocytose20,21. Bien que les cellules chromaffines contiennent de grandes vésicules à noyau dense, tandis que les synapses contiennent de petites vésicules synaptiques, les protéines d’exocytose et d’endocytose dans les cellules chromaffines et les synapses sont assez analogues 10,11,12,20,21,22,23.

Ici, une méthode est décrite pour mesurer ces trois modes de fusion à l’aide d’une méthode d’imagerie confocale combinée à l’électrophysiologie dans les cellules chromaffines surrénales bovines (Figure 1). Cette méthode consiste à charger de faux neurotransmetteurs fluorescents (FFN511) dans des vésicules pour détecter l’exocytose; ajout d’Atto 655 (A655) dans la solution de bain pour remplir le profil en forme de Ω généré par fusion, et marquage de la membrane plasmique avec le domaine PH de la phospholipase C δ (PH), qui se lie à PtdIns(4,5)P2 à la membrane plasmique 8,15,24. La dynamique des pores de fusion peut être détectée par des changements dans différentes intensités fluorescentes. Bien que décrit pour les cellules chromaffines, le principe de cette méthode décrit ici peut être largement appliqué à de nombreuses cellules sécrétoires bien au-delà des cellules chromaffines.

Protocol

REMARQUE: La procédure d’utilisation des animaux a suivi les directives des NIH et a été approuvée par le nih Animal Care and Use Committee. 1. Culture de cellules chromaffines bovines Préparer la solution de Locke (Tableau 1) et les outils d’autoclave 1 jour avant la culture de cellules chromaffines. Obtenez des glandes surrénales bovines d’un abattoir local le jour de la culture et gardez-les immergées dans la solution glacé…

Representative Results

À la suite des procédures expérimentales illustrées aux figures 1 et 2, les cellules chromaffines des glandes surrénales bovines ont été transfectées avec du PH-mNG pour marquer la membrane plasmique; L’A655 a été ajouté à la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion; et le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 a été chargé dans les vésicules pour la détection de la libération. Ensuite, l’imagerie du timelapse con…

Discussion

Une méthode d’imagerie microscopique confocale est décrite pour détecter la dynamique des pores de fusion et de la libération du transmetteur, ainsi que trois modes de fusion, la fusion rapprochée, la fusion de séjour et la fusion rétractable dans les cellules chromaffines surrénales bovines 4,24. Une méthode électrophysiologique pour dépolariser la cellule et ainsi évoquer l’exo- et l’endocytose est décrite. Le traitement systématique des ima…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les programmes de recherche intra-muros du NINDS (ZIA NS003009-13 et ZIA NS003105-08) d’avoir soutenu ce travail.

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

参考文献

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記事を引用
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

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