概要

Microscopía confocal para medir tres modos de dinámica de poros de fusión en células cromafines suprarrenales

Published: March 16, 2022
doi:

概要

Este protocolo describe una técnica de imagen confocal para detectar tres modos de fusión en células cromafines suprarrenales bovinas. Estos modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y el cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción de la vesícula fusionada.

Abstract

La apertura y el cierre dinámicos de los poros de fusión median la exocitosis y la endocitosis y determinan su cinética. Aquí, se demuestra en detalle cómo se utilizó la microscopía confocal en combinación con el registro de pinza de parche para detectar tres modos de fusión en células de cromafina suprarrenal bovina de cultivo primario. Los tres modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción del perfil en forma de Ω generado por la fusión hasta que se fusiona completamente en la membrana plasmática.

Para detectar estos modos de fusión, la membrana plasmática se marcó sobreexpresando mNeonGreen unido con el dominio PH de la fosfolipasa C δ (PH-mNG), que se une al fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) en la valva orientada al citosol de la membrana plasmática; las vesículas se cargaron con el falso neurotransmisor fluorescente FFN511 para detectar la liberación de contenido vesicular; y Atto 655 se incluyó en la solución de baño para detectar el cierre de poros de fusión. Estas tres sondas fluorescentes se tomaron imágenes simultáneamente a ~ 20-90 ms por cuadro en células cromafines vivas para detectar la apertura del poro de fusión, la liberación de contenido, el cierre del poro de fusión y la fusión de cambios en el tamaño de la vesícula. El método de análisis se describe para distinguir tres modos de fusión de estas mediciones de fluorescencia. El método descrito aquí puede, en principio, aplicarse a muchas células secretoras más allá de las células cromafines.

Introduction

La fusión de membrana media muchas funciones biológicas, incluida la transmisión sináptica, la homeostasis de la glucosa en sangre, la respuesta inmune y la entrada viral 1,2,3. La exocitosis, que implica la fusión de vesículas en la membrana plasmática, libera neurotransmisores y hormonas para lograr muchas funciones importantes, como las actividades de la red neuronal. La fusión abre un poro para liberar contenido vesicular, después de lo cual el poro puede cerrarse para recuperar la vesícula fusionante, que se denomina kiss-and-run 1,4. Tanto la apertura irreversible como reversible del poro de fusión se puede medir con grabaciones de capacitancia conectadas a células combinadas con grabaciones de conductancia de poro de fusión de fusión de una sola vesícula.

Esto a menudo se interpreta como un reflejo de la fusión de colapso completo, que implica la dilatación de la fusión hasta el aplanamiento de la vesícula fusionada, y el beso y la carrera, que implica la apertura y el cierre del poro de fusión, respectivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estudios recientes de imágenes de agotamiento por emisión confocal y estimulada (STED) en células cromafines observaron directamente la apertura y el cierre del poro de fusión (kiss-and-run, también llamado close-fusion), la apertura del poro de fusión que mantiene una forma de Ω con un poro abierto durante mucho tiempo, denominada fusión de permanencia y la reducción de la vesícula fusionante hasta que se fusiona completamente con la membrana plasmática, que reemplaza la fusión de colapso completo para fusionar las vesículas fusionadas con la membrana plasmática4, 8,14,15,16,17.

En las neuronas, se han detectado apertura y cierre de poros de fusión con imágenes que muestran la liberación de puntos cuánticos precargados en vesículas que son más grandes que el poro de fusión y con mediciones de conductancia de poro de fusión en la cara de liberación de terminales nerviosos 5,18,19. Las células cromafines suprarrenales son ampliamente utilizadas como modelo para el estudio de la exocitosis y la endocitosis20,21. Aunque las células cromafines contienen grandes vesículas de núcleo denso, mientras que las sinapsis contienen pequeñas vesículas sinápticas, las proteínas de exocitosis y endocitosis en las células cromafines y sinapsis son bastante análogas 10,11,12,20,21,22,23.

Aquí, se describe un método para medir estos tres modos de fusión utilizando un método de imagen confocal combinado con electrofisiología en células de cromafin suprarrenal bovina (Figura 1). Este método consiste en la carga de falsos neurotransmisores fluorescentes (FFN511) en vesículas para detectar la exocitosis; adición de Atto 655 (A655) en la solución de baño para llenar el perfil en forma de Ω generado por fusión, y etiquetado de la membrana plasmática con el dominio PH de fosfolipasa C δ (PH), que se une a PtdIns(4,5)P2 en la membrana plasmática 8,15,24. La dinámica de los poros de fusión se puede detectar a través de cambios en diferentes intensidades fluorescentes. Aunque se describe para las células cromafines, el principio de este método descrito aquí se puede aplicar ampliamente a muchas células secretoras mucho más allá de las células cromafines.

Protocol

NOTA: El procedimiento de uso de animales siguió las pautas de los NIH y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de los NIH. 1. Cultivo de células de cromafina bovina Preparar la solución de Locke (Tabla 1) y las herramientas de autoclave 1 día antes del cultivo celular de cromafines. Obtenga glándulas suprarrenales bovinas de un matadero local el día del cultivo y manténgalas sumergidas en la solución helada de Loc…

Representative Results

Siguiendo los procedimientos experimentales mostrados en la Figura 1 y la Figura 2, las células cromafines de las glándulas suprarrenales bovinas fueron transfectadas con PH-mNG para etiquetar la membrana plasmática; Se agregó A655 a la solución de baño para detectar el cierre de poros de fusión; y el falso neurotransmisor fluorescente FFN511 se cargó en vesículas para la detección de liberación. A continuación, se realizaron imágenes de lapso de ti…

Discussion

Se describe un método de imagen microscópica confocal para detectar la dinámica de la liberación de poros y transmisores de fusión, así como tres modos de fusión, fusión cercana, fusión de permanencia y fusión retráctil en células cromafines suprarrenales bovinas 4,24. Se describe un método electrofisiológico para despolarizar la célula y, por lo tanto, evocar exocitosis y endocitosis. El procesamiento sistemático de imágenes confocales proporcio…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los Programas de Investigación Intramuros del NINDS (ZIA NS003009-13 y ZIA NS003105-08) por apoyar este trabajo.

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

参考文献

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).

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記事を引用
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

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