概要

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Published: March 16, 2022
doi:

概要

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Abstract

Dynamische fusieporieopening en -sluiting bemiddelen exocytose en endocytose en bepalen hun kinetiek. Hier wordt in detail gedemonstreerd hoe confocale microscopie werd gebruikt in combinatie met patch-clamp-opname om drie fusiemodi in primaire cultuur bovine adrenal chromaffine cellen te detecteren. De drie fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken is, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij het fusie-gegenereerde Ω-vormige profiel krimpt totdat het volledig samensmelt bij het plasmamembraan.

Om deze fusiemodi te detecteren, werd het plasmamembraan gelabeld door mNeonGreen te overexpresseren dat verbonden is met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH-mNG), dat bindt aan fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PtdIns(4,5)P2) in de cytosolgerichte folder van het plasmamembraan; blaasjes werden geladen met de fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 om vesiculaire inhoudsafgifte te detecteren; en Atto 655 werd opgenomen in de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren. Deze drie fluorescerende sondes werden gelijktijdig in beeld gebracht met ~ 20-90 ms per frame in levende chromaffinecellen om fusieporieopening, inhoudsafgifte, fusieporiesluiting en veranderingen in de grootte van blaasjes te detecteren. De analysemethode wordt beschreven om drie fusiemodi van deze fluorescentiemetingen te onderscheiden. De hier beschreven methode kan in principe van toepassing zijn op veel secretoire cellen buiten chromaffinecellen.

Introduction

Membraanfusie bemiddelt veel biologische functies, waaronder synaptische transmissie, bloedglucosehomeostase, immuunrespons en virale entry 1,2,3. Exocytose, waarbij blaasjesfusie op het plasmamembraan betrokken is, geeft neurotransmitters en hormonen vrij om veel belangrijke functies te bereiken, zoals neuronale netwerkactiviteiten. Fusie opent een porie om vesiculaire inhoud vrij te maken, waarna de porie kan sluiten om het fuserende blaasje op te halen, dat kiss-and-run 1,4 wordt genoemd. Zowel onomkeerbare als omkeerbare fusieporieopening kan worden gemeten met celgebonden capaciteitsregistraties in combinatie met fusieporiegeleidingsopnamen van enkelvoudige blaasjesfusie.

Dit wordt vaak geïnterpreteerd als een weerspiegeling van volledige collapsfusie, waarbij de fusie wordt verwijd tot het afvlakken van het fuserende blaasje, en kiss-and-run, waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken zijn, respectievelijk 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recente confocale en gestimuleerde emissiedepletie (STED) beeldvormingsstudies in chromaffinecellen hebben direct waargenomen dat fusieporieopening en -sluiting (kiss-and-run, ook wel close-fusion genoemd), fusieporieopening die lange tijd een Ω-vorm met een open porie handhaaft, genaamd stay-fusion, en krimpen van het fuserende blaasje totdat het volledig samensmelt met het plasmamembraan, dat volledige fusie vervangt voor het samenvoegen van fuserende blaasjes met het plasmamembraan4, 8,14,15,16,17.

In neuronen zijn het openen en sluiten van fusieporiën gedetecteerd met beeldvorming die de afgifte laat zien van quantum dots die vooraf zijn geladen in blaasjes die groter zijn dan de fusieporie en met fusieporiegeleidingsmetingen aan het afgiftevlak van zenuwterminals 5,18,19. Bijnierchromaffinecellen worden veel gebruikt als model voor de studie van exo- en endocytose20,21. Hoewel chromaffinecellen grote blaasjes met dichte kern bevatten, terwijl synapsen kleine synaptische blaasjes bevatten, zijn de exocytose- en endocytose-eiwitten in chromaffinecellen en synapsen vrij analoog 10,11,12,20,21,22,23.

Hier wordt een methode beschreven om deze drie fusiemodi te meten met behulp van een confocale beeldvormingsmethode in combinatie met elektrofysiologie in boviene bijnierchromaffinecellen (figuur 1). Deze methode omvat het laden van fluorescerende valse neurotransmitters (FFN511) in blaasjes om exocytose te detecteren; toevoeging van Atto 655 (A655) in de badoplossing om het door fusie gegenereerde Ω-vormige profiel te vullen, en etikettering van het plasmamembraan met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH), dat bindt aan PtdIns(4,5)P2 op het plasmamembraan 8,15,24. Fusieporiëndynamiek kan worden gedetecteerd door veranderingen in verschillende fluorescerende intensiteiten. Hoewel beschreven voor chromaffinecellen, kan het principe van deze hier beschreven methode op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen ver buiten chromaffinecellen.

Protocol

OPMERKING: De procedure voor het gebruik van dieren volgde de NIH-richtlijnen en werd goedgekeurd door de NIH Animal Care and Use Committee. 1. Boviene chromaffine celcultuur Bereid Locke’s oplossing (tabel 1) en autoclaafgereedschappen 1 dag vóór de chromaffinecelkweek. Verkrijg runderbijnieren uit een lokaal slachthuis op de cultuurdag en houd ze ondergedompeld in ijskoude Locke’s oplossing voordat ze worden gedissectie.OPMERKING: B…

Representative Results

Volgens de experimentele procedures in figuur 1 en figuur 2 werden chromaffinecellen uit runderbijnieren getransfecteerd met PH-mNG om het plasmamembraan te labelen; A655 werd toegevoegd aan de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren; en fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 werd geladen in blaasjes voor detectie van afgifte. Vervolgens werd XY-plane confocale timelapse beeldvorming van FFN511, PH-mNG en A655 elke 20-90 ms aan de celbodem uitge…

Discussion

Een confocale microscopische beeldvormingsmethode wordt beschreven om de dynamiek van fusieporie en zenderafgifte te detecteren, evenals drie fusiemodi, close-fusion, stay-fusion en shrink-fusion in bovine adrenal chromaffin cells 4,24. Een elektrofysiologische methode om de cel te depolariseren en daarbij exo- en endocytose op te roepen wordt beschreven. Systematische confocale beeldverwerking biedt informatie over verschillende vormen van poriegedrag voor fusie…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken de NINDS Intramurale Onderzoeksprogramma’s (ZIA NS003009-13 en ZIA NS003105-08) voor het ondersteunen van dit werk.

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

参考文献

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).

Play Video

記事を引用
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

View Video