تطبيق النهج القائمة على البحث المفتوح لتحديد الجليكوببتيدات المرتبطة ب Acinetobacter baumannii O

غليكوزيل البروتين ، عملية ربط الكربوهيدرات بجزيئات البروتين ، هي واحدة من أكثر التعديلات ما بعد الانتقالية شيوعا (PTMs) في الطبيعة ^1,2. في جميع مجالات الحياة ، تطورت مجموعة من الآلات المعقدة المخصصة لتوليد البروتينات السكرية التي تؤثر على عدد لا يحصى من الوظائف الخلوية¹،^3،4،5. في حين أن غليكوزيل البروتين يحدث على مجموعة من الأحماض الأمينية ^6,7 ، فإن أحداث الجليكوزيل المرتبطة ب N و O هما شكلان مهيمنان لوحظا في الطبيعة. يتضمن الغليكوزيل المرتبط ب N ربط الجليكان بذرة نيتروجين من بقايا الأسباراجين (Asn) ، بينما في الغليكوزيل المرتبط ب O ، يتم ربط الجليكان بذرة أكسجين من بقايا سيرين (Ser) أو ثريونين (Thr) أو التيروزين (Tyr)⁷. على الرغم من أوجه التشابه في المخلفات التي تستهدفها أنظمة الجليكوزيل ، فإن الاختلافات داخل الجليكان المرتبطة بالبروتينات تؤدي إلى كون الجليكوزيل هو الفئة الأكثر تنوعا كيميائيا من PTMs الموجودة في الطبيعة.

في حين أن أنظمة الجليكوزيل حقيقية النواة تمتلك تنوع الجليكان ، فإن هذه الأنظمة عادة ما تكون مقيدة في عدد الكربوهيدرات الفريدة المستخدمة. ينبع التنوع الناتج من كيفية ترتيب هذه الكربوهيدرات في جليكان⁸،⁹،^10،11،12. في المقابل ، تمتلك الأنواع البكتيرية والقديمة تنوعا غير محدود تقريبا من الجليكان بسبب المجموعة الهائلة من السكريات الفريدة المتولدة داخل هذه الأنظمة²،10،13،14،¹⁵،^16،17. تمثل هذه الاختلافات في تنوع الجليكان الذي لوحظ عبر مجالات الحياة تحديا تحليليا كبيرا لتوصيف وتحديد أحداث الغليكوزيل. بالنسبة للغليكوزيل حقيقي النواة ، فإن القدرة على توقع تركيبات الجليكان قد سهلت الاهتمام المتزايد بعلم الأحياء السكرية. ومع ذلك ، فإن الشيء نفسه لا ينطبق على الجليكوزيل البكتيري ، الذي لا يزال مقتصرا إلى حد كبير على الدراسة من قبل المختبرات المتخصصة. مع زيادة إمكانية الوصول إلى أجهزة قياس الطيف الكتلي (MS) في العلوم البيولوجية ، أصبحت النهج القائمة على MS الآن الطريقة الأساسية لتحليل glycoproteomic.

برز مرض التصلب العصبي المتعدد كأداة مثالية لتوصيف الجليكوزيل، مع استخدام كل من النهج من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى الآن بشكل شائع لتوصيف البروتينات السكرية⁶. في حين يتم استخدام البروتيوميات من أعلى إلى أسفل لتقييم أنماط الغليكوزيل العالمية لبروتينات محددة^18,19 ، يتم استخدام النهج من أسفل إلى أعلى لتمكين التوصيف الخاص بالجليكان من glycopeptides ، حتى من المخاليط المعقدة^{6,20,21,22,23}. لتحليل glycopeptides ، يعد توليد معلومات التجزئة الإعلامية ضروريا لتوصيف أحداث glycosylation^24,25. ويمكن الآن الوصول إلى مجموعة من نهج التجزئة بشكل روتيني على الأدوات، بما في ذلك التفكك الناجم عن التصادم القائم على مصيدة أيون الرنين (IT-CID)، والتفكك الناجم عن التصادم من نوع الحزمة (CID)، وتفكك نقل الإلكترون (ETD). يمتلك كل نهج نقاط قوة وضعف مختلفة لتحليل الجليكوببتيد 25,26 ، مع تقدم كبير خلال العقد الماضي في تطبيق نهج التجزئة هذه لتحليل الغليكوزيل ^6,20. ومع ذلك ، بالنسبة لتحليل الغليكوزيل البكتيري ، لم يكن القيد الحرج هو القدرة على تفتيت الجليكوببتيدات ولكن بالأحرى عدم القدرة على التنبؤ بتركيبات الجليكان المحتملة داخل العينات. داخل هذه الأنظمة ، تحد الطبيعة غير المعروفة للجليكان البكتيري المتنوع من تحديد الجليكوببتيدات ، حتى مع أدوات البحث التي تركز على الغليكوزيل الشائعة الآن لتحليل الجليكوببتيدات حقيقية النواة ، مثل O-Pair²⁷ و GlycopeptideGraphMS²⁸ و GlycReSoft²⁹. للتغلب على هذه المشكلة ، هناك حاجة إلى طريقة بحث بديلة ، مع استخدام أدوات البحث المفتوحة الناشئة كنهج قوي لدراسة الغليكوزيل البكتيري³⁰.

يسمح البحث المفتوح ، المعروف أيضا باسم البحث الأعمى أو بحرف البدل ، بتحديد الببتيدات ذات PTMs ^21,30,31,32 غير المعروفة أو غير المتوقعة. تستخدم عمليات البحث المفتوحة مجموعة متنوعة من التقنيات الحسابية ، بما في ذلك عمليات البحث عن التعديل المنسق ، أو عمليات البحث في قاعدة البيانات متعددة الخطوات ، أو البحث المتسامح على نطاق واسع³³،34،³⁵،^36،37. على الرغم من أن البحث المفتوح ينطوي على إمكانات كبيرة ، إلا أن استخدامه عادة ما يعوقه الزيادة الكبيرة في أوقات التحليل وفقدان حساسية الكشف عن الببتيدات غير المعدلة مقارنة بعمليات البحث المقيدة^31,32. الانخفاض في الكشف عن التطابقات الطيفية الببتيد غير المعدلة (PSMs) هو نتيجة لزيادة معدلات PSM الإيجابية الكاذبة المرتبطة بهذه التقنيات ، الأمر الذي يتطلب زيادة التصفية الصارمة للحفاظ على معدلات الاكتشاف الخاطئ المطلوبة (FDRs) ³³،^34،35،^36،37 . في الآونة الأخيرة ، أصبحت العديد من الأدوات المتاحة تعمل على تحسين إمكانية الوصول إلى البحث المفتوح بشكل كبير ، بما في ذلك Byonic 31,38 و Open-pFind ³⁹ و ANN-SoLo 40 و MSFragger^21,41. تمكن هذه الأدوات من التحديد القوي لأحداث الغليكوزيل من خلال تقليل أوقات التحليل بشكل كبير وتنفيذ نهج للتعامل مع تركيبات الجليكان غير المتجانسة.

تقدم هذه المقالة طريقة مبسطة لتحديد الببتيدات السكرية البكتيرية عن طريق البحث المفتوح ، باستخدام مسببات الأمراض في المستشفيات سالبة الجرام ، Acinetobacter baumannii ، كنموذج. يمتلك A. baumannii نظام جليكوزيل مرتبط ب O محفوظ مسؤول عن تعديل ركائز البروتين المتعددة ، والمعروف باسم نظام غليكوزيل البروتين PglL^42,43,44. في حين يتم استهداف بروتينات مماثلة للغليكوزيل بين السلالات ، فإن نظام غليكوزيل PglL متغير للغاية بسبب التخليق الحيوي للجليكان المستخدم في غليكوزيل البروتين المشتق من موضع الكبسولة (المعروف باسم K-locus) ⁴⁴،^45،46. ينتج عن ذلك جليكان متنوع (يعرف أيضا باسم وحدة K) ، مشتقة من وحدات K المبلمرة المفردة أو المحدودة ، التي تضاف إلى ركائز البروتين 30,44,46. ضمن هذا العمل ، يتم استخدام أداة البحث المفتوحة ، MSfragger ، داخل برنامج FragPipe ، لتحديد الجليكان عبر سلالات A. baumannii. من خلال الجمع بين البحث المفتوح والتنظيم اليدوي ، يمكن إجراء “عمليات بحث تركز على الجليكان” لزيادة تحسين تحديد الببتيدات البكتيرية. معا ، يتيح نهج تحديد الهوية متعدد الخطوات هذا تحديد الجليكوببتيدات دون خبرة واسعة في توصيف أحداث الجليكوزيل الجديدة.