Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden

Die Proteinglykosylierung, der Prozess der Bindung von Kohlenhydraten an Proteinmoleküle, ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen (PTMs) in der Natur ^1,2. In allen Bereichen des Lebens hat sich eine Reihe komplexer Maschinen entwickelt, die sich der Erzeugung von Glykoproteinen widmen, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen beeinflussen 1,3,4,5. Während die Proteinglykosylierung auf einer Reihe von Aminosäuren^6,7 auftritt, sind N-verknüpfte und O-verknüpfte Glykosylierungsereignisse zwei dominante Formen^, die in der Natur beobachtet werden. Bei der N-verknüpften Glykosylierung werden Glykane an ein Stickstoffatom von Asparaginresten (Asn) gebunden, während bei der O-verknüpften Glykosylierung Glykane an ein Sauerstoffatom aus Serin (Ser), Threonin (Thr) oder Tyrosin (Tyr) -Rückständen^{gebunden sind 7}. Trotz der Ähnlichkeiten in den Rückständen, auf die Glykosylierungssysteme abzielen, führen die Unterschiede innerhalb der an Proteine gebundenen Glykane dazu, dass die Glykosylierung die chemisch vielfältigste Klasse von PTMs ist, die in der Natur vorkommen.

Während eukaryotische Glykosylierungssysteme eine Glykandiversität besitzen, sind diese Systeme typischerweise in der Anzahl der verwendeten einzigartigen Kohlenhydrate begrenzt. Die resultierende Vielfalt ergibt sich aus der Art und Weise, wie diese Kohlenhydrate in Glykanen 8,9,10,11,12 angeordnet sind. Im Gegensatz dazu besitzen bakterielle und archaeale Arten aufgrund der schieren Auswahl an einzigartigen Zuckern, die in diesen Systemen erzeugt werden, eine praktisch unbegrenzte Glykanvielfalt 2,10,13,14,15,16,17. Diese Unterschiede in der Glykandiversität, die über Lebensbereiche hinweg beobachtet werden, stellen eine bedeutende analytische Herausforderung für die Charakterisierung und Identifizierung von Glykosylierungsereignissen dar. Für die eukaryotische Glykosylierung hat die Fähigkeit, Glykanzusammensetzungen zu antizipieren, das wachsende Interesse an der Glykobiologie erleichtert; Gleiches gilt jedoch nicht für die bakterielle Glykosylierung, die immer noch weitgehend auf die Untersuchung durch spezialisierte Labors beschränkt ist. Da die Zugänglichkeit von Instrumenten der Massenspektrometrie (MS) in den Biowissenschaften zugenommen hat, sind MS-basierte Ansätze heute die primäre Methode für die glykoproteomische Analyse.

MS hat sich als das wichtigste Werkzeug für die Charakterisierung der Glykosylierung herausgestellt, wobei sowohl Top-down- als auch Bottom-up-Ansätze heute häufig zur Charakterisierung von Glykoproteinen^{verwendet werden 6}. Während Top-down-Proteomik verwendet wird, um globale Glykosylierungsmuster spezifischer Proteine^18,19 zu bewerten, werden Bottom-up-Ansätze verwendet, um die glykanspezifische Charakterisierung von Glykopeptiden zu ermöglichen, selbst aus komplexen Mischungen^{6,20,21,22,23}. Für die Analyse von Glykopeptiden ist die Generierung von informativen Fragmentierungsinformationen für die Charakterisierung von Glykosylierungsereignissen^{essentiell 24,25}. Eine Reihe von Fragmentierungsansätzen ist jetzt routinemäßig auf Instrumenten zugänglich, darunter die auf Resonanzionenfallen basierende kollisionsinduzierte Dissoziation (IT-CID), die kollisionsinduzierte Dissoziation vom Strahltyp (CID) und die Elektronentransferdissoziation (ETD). Jeder Ansatz besitzt unterschiedliche Stärken und Schwächen für die Glykopeptidanalyse 25,26, mit signifikanten Fortschritten in den letzten zehn Jahren bei der Anwendung dieser Fragmentierungsansätze zur Analyse der Glykosylierung ^6,20. Für die bakterielle Glykosylierungsanalyse war die entscheidende Einschränkung jedoch nicht die Fähigkeit, Glykopeptide zu fragmentieren, sondern die Unfähigkeit, die potenziellen Glykanzusammensetzungen in Proben vorherzusagen. Innerhalb dieser Systeme schränkt die unbekannte Natur verschiedener bakterieller Glykane die Identifizierung von Glykopeptiden ein, selbst mit Glykosylierungs-fokussierten Suchwerkzeugen, die heute für die Analyse eukaryotischer Glykopeptide wie O-Pair²⁷, GlycopeptideGraphMS 28 und GlycReSoft²⁹ üblich sind. Um dieses Problem zu lösen, ist eine alternative Suchmethode erforderlich, wobei sich der Einsatz offener Suchwerkzeuge als leistungsfähiger Ansatz für die Untersuchung der bakteriellen Glykosylierung^{herausstellt 30}.

Die offene Suche, auch Blind- oder Wildcard-Suche genannt, ermöglicht die Identifizierung von Peptiden mit unbekannten oder unerwarteten PTMs 21,30,31,32. Offene Suchen verwenden eine Vielzahl von Berechnungstechniken, einschließlich kuratierter Modifikationssuchen, mehrstufiger Datenbanksuchen oder massentoleranter Suche 33,34,35,36,37. Obwohl die offene Suche ein großes Potenzial hat, wurde ihre Verwendung typischerweise durch die signifikante Zunahme der Analysezeiten und den Verlust der Empfindlichkeit des Nachweises von unmodifizierten Peptiden im Vergleich zu eingeschränkten Suchen^{behindert 31,32}. Die Abnahme des Nachweises von unmodifizierten Peptid-Spektral-Matches (PSMs) ist ein Ergebnis der erhöhten falsch-positiven PSM-Raten, die mit diesen Techniken verbunden sind, was eine erhöhte strenge Filterung erfordert, um die gewünschten Falscherkennungsraten (FDRs) aufrechtzuerhalten 33,34,35,36,37 . In letzter Zeit sind mehrere Tools verfügbar, die die Zugänglichkeit der offenen Suche erheblich verbessern, darunter Byonic 31,38, Open-pFind ³⁹, ANN-SoLo 40 und MSFragger^21,41. Diese Werkzeuge ermöglichen die robuste Identifizierung von Glykosylierungsereignissen, indem sie die Analysezeiten erheblich reduzieren und Ansätze zur Handhabung heterogener Glykanzusammensetzungen implementieren.

Dieser Artikel stellt eine optimierte Methode zur Identifizierung bakterieller Glykopeptide durch offene Suche am Beispiel des gramnegativen nosokomialen Erregers Acinetobacter baumannii vor. A. baumannii besitzt ein konserviertes O-verknüpftes Glykosylierungssystem, das für die Modifikation mehrerer Proteinsubstrate verantwortlich ist, bekannt als das PglL-Proteinglykosylierungssystem^42,43,44. Während ähnliche Proteine auf die Glykosylierung zwischen Stämmen abzielen, ist das PglL-Glykosylierungssystem aufgrund der Biosynthese des Glykans, das für die Proteinglykosylierung verwendet wird, sehr variabel, da es vom Kapselort (bekannt als K-Locus) abgeleitet ist44,45,46. Dies führt dazu, dass verschiedene Glykane (auch bekannt als K-Einheit), die aus einzelnen oder begrenzten polymerisierten K-Einheiten abgeleitet sind, zu Proteinsubstraten 30,44,46 hinzugefügt werden. Innerhalb dieser Arbeit wird die Verwendung des offenen Suchwerkzeugs MSfragger innerhalb der Software FragPipe verwendet, um Glykane über A. baumannii-Stämme zu identifizieren. Durch die Kombination von offener Suche und manueller Kuration können “glykanfokussierte Suchen” durchgeführt werden, um die Identifizierung bakterieller Glykopeptide weiter zu verbessern. Zusammen ermöglicht dieser mehrstufige Identifikationsansatz die Identifizierung von Glykopeptiden ohne umfangreiche Erfahrung in der Charakterisierung neuartiger Glykosylierungsereignisse.